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1、糖鎖遊離酵素遺伝子の大腸菌での発現系の構築
クローニングした同酵素遺伝子をプラスミドに挿入し、大腸菌の形質転換体を作成した。また、アフィニティー精製や発現タンパク質の可溶化促進のためのタグ遺伝子を付加し、その発現系も構築した。さらに、同遺伝子のうち、活性に必要な領域の発現系も構築した。その結果、酵素分子中の一部領域を除いた遺伝子を発現する大腸菌の発現系を構築することができた。また、アフィニティー精製のためのタグや可溶化促進タグ遺伝子を付加した発現系も構築することができた。そして、様々な発現誘導条件を検討したところ、特定の誘導条件下で可溶性の状態で発現した。こうして、安定的に酵素を生産する基盤を構築することができた。
2、発現酵素の精製法の確立
アフィニティークロマトグラフィーによる精製のために、溶出条件などの諸条件を検討し、アフィニティータグの付加した発現酵素の大腸菌かちの最適な分離精製法を検討した。その結果、アフィニティーカラムには吸着しなかった。このため、同タグを付加しない酵素を発現させ、その精製法を検討したところ、2段階のカラムクロマトグラフィーによって高い回収率で精製酵素票品を得ることに成功した。こうして、精製した酵素を迅速に得ることができるようになり、高純度の酵素を糖鎖の遊離や糖鎖転移による生体認識配糖体の合成に利用する基盤が出来上がった。また、同酵素の立体構造解析に必要な結晶を調製するために必要な量の精製酵素標品を得ることができるようになった。
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