ホモKOブタ個体作成のためのdouble KO細胞の標準的取得法の開発

2011 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 21580350
• 研究機関: 鹿児島大学
• 研究代表者: 佐藤 正宏 鹿児島大学, フロンティアサイエンス研究推進センター, 教授 (30287099)
• キーワード: KOブタ / ホモ / gene targeting / 薬剤耐性 / 体細胞核移植 / 胎仔性繊維芽細胞 / 遺伝子導入 / double KO

研究概要

特定の遺伝子機能が破壊されたいわゆるKOブタ個体を作成するには、マウスの場合と異なり、in vitroでのホモKO体細胞の作成、その体細胞核移植という経路を辿る。ブタの場合、ホモKO細胞の作成は、その後の実験のスピードを左右する重要な問題である。ヘテロKO細胞由来の個体に比べ、2年ほど実験時間が短縮されるからである。ホモKO体細胞の作成に至る種々の条件(薬剤耐性性等)が不明故、基本的な問題を検討した。その結果、ミニブタ胎仔性繊維芽細胞(PEF)は、blasticydine S, hygromycin B, zeocin等の様々な薬剤に感受性があった(Sato et al., in press)。なお、予備的な検討では、puromycin等の薬剤では、濃度を高めることで、組換え細胞の死滅が誘導された。
通常のKOシステムでは、内在性の標的遺伝子を破壊するために、いわゆるgene targeting (GT) vectorの構築が必要となる。今回細胞表面糖鎖であるα-Galepitopeを合成する酵素α-1,3-GalTをコードする遺伝子を標的とした。GT vectorとしてpuromycin耐性遺伝子(puro)を有するvector pPGalTを構築した。これを腎臓上皮由来細胞に遺伝子導入した(以前は、PEFをドナー細胞に用いていたが、重複の遺伝子導入には耐えられず、不適と判断)。得られたヘテロKO細胞に更にpPGalTを導入し、細胞を高濃度のpuromycinで選別することで、ホモKO細胞を得た(論文作成中)。この場合、ホモKO細胞は、α-Galepitopeを無くすので、それを識別するBS-I-B4レクチンに毒素(saporin)を結合させたIB4-SAPで遺伝子導入後の細胞を処理すると、簡単にホモKO細胞を濃縮出来る。後は、体細胞核移植経由でブタ個体を作成するのみであるが、与えられた補助金の期限内ではまだ時間が足らなかった。現在、更なる実験を継続中である。

研究成果

• [雑誌論文] Expression analysis of a α-1,3-galactosyltransferase, an enzyme that creates xenotransplantation-related α-Gal epitope, in pig preimplantation embryos (2012)
  • 著者名/発表者名: Chi H, Sato M, Yoshida M, Miyoshi K
  • 雑誌名: Animal Science Journal 巻: 83 ページ: 88-93
  • 査読あり
• [雑誌論文] Successful suppression of endogenous α-1, 3-galactosyltransferase expression by RNA interference in pig embryos generated in vitro (2012)
  • 著者名/発表者名: Chi H, Shinohara M, Yokomine T, Sato M, Takao S, Yoshida M, Miyoshi K
  • 雑誌名: Journal of Reproduction and Developmen 巻: 58 ページ: 69-76
  • 査読あり
• [雑誌論文] Targeted transgenesis through pronuclear injection of improved vectors into in vitro fertilized eggs (2012)
  • 著者名/発表者名: Ohtsuka M, Miura H, Nakaoka H, Kimura M, Sato M, Inoko H
  • 雑誌名: Transgenic Research 巻: 21 ページ: 225-226
  • 査読あり
• [雑誌論文] Determination of the optimal concentration of several selective drugs useful for generating multi-transgenic porcine embryonic fibroblasts (2012)
  • 著者名/発表者名: Sato M, Ohtsuka M, Miura H, Miyoshi K, Watanabe S
  • 雑誌名: Reproduction in Domestic Animals 巻: (in press)
  • 査読あり
• [雑誌論文] Generation of a set of mouse STO feeder cell lines that confer resistance to several types of selective drugs (2012)
  • 著者名/発表者名: Saitoh I, Sato M, Iwase Y, Akasaka E, Yamasaki Y, Noguchi H
  • 雑誌名: Cell Medicine (Part B of Cell Transplantation) 巻: (in press)
  • 査読あり
• [雑誌論文] Whole-genome amplification-based GenomiPhi for multiple genomic analys is of individual early porcine embryos (2011)
  • 著者名/発表者名: Akasaka E, Ozawa A, Mori H, Mizobe Y, Yoshida M, Miyoshi K, Sato M
  • 雑誌名: Theriogenology/Elsevier B.V. 巻: 75 ページ: 1543-1549
  • 査読あり
• [雑誌論文] Cultivation with untransfected fibroblasts can stimulate proliferation of a single gene-modified fibroblast derived from a Clawn miniature swine fetus (2011)
  • 著者名/発表者名: Sato M, Yoshida M, Miyoshi K, Ohtsuka M, Watanabe S
  • 雑誌名: Reproduction in Domestic Animals 巻: 46 ページ: 911-916
  • 査読あり
• [雑誌論文] Improvement of a phiC31 integrase-based gene delivery system that confers high and continuous transgene expression (2011)
  • 著者名/発表者名: Watanabe S, Nakamura S, Sakurai T, Akasaka K, Sato M
  • 雑誌名: New Biotechnology 巻: 28 ページ: 312-319
  • 査読あり
• [雑誌論文] A novel glycosylation signal regulates transforming growth factor receptors as evidenced by endo-β-galactosidase C expression in rodent cells (2011)
  • 著者名/発表者名: Watanabe S, Misawa M, Matsuzaki T, Sakurai T, Muramatsu T, Sato M
  • 雑誌名: Glycobiology 巻: 21 ページ: 482-492
  • 査読あり
• [雑誌論文] Simple cloning strategy using GFPuv gene as positive/negative indicator (2011)
  • 著者名/発表者名: Miura H, Inoko H, Inoue I, Tanaka M, Sato M, Ohtsuka M
  • 雑誌名: Analytical Biochemistry 巻: 416 ページ: 237-239
  • 査読あり
• [雑誌論文] Innate immune system still works at diapause, a physiological state of dormancy in insects (2011)
  • 著者名/発表者名: Nakamura A, Takezawa Y, Ohnami N, Sato M, Ono C, Harada Y, Yoshida K, Kawano N, Kanai S, Miyado M, Umezawa A
  • 雑誌名: Biochemical and Biophysical Research Communication 巻: 410 ページ: 351-357
  • 査読あり
• [雑誌論文] Beta-catenin is a molecular switch that regulates transition of cell-cell adhesion to fusion (2011)
  • 著者名/発表者名: Takezawa Y, Yoshida K, Miyado K, Sato M, Nakamura A, Kawano N, Sakakibara K, Kondo T, Harada Y, Ohnami N, Kanai S, Miyado M, Saito H, Takahashi Y, Akutsu H, Umezawa A
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 1 ページ: 68
  • 査読あり
• [雑誌論文] Targeted toxin as a useful reagent for enrichment of α-Gal epitope-negative cells used for somatic cell nuclear transfer in pigs (2011)
  • 著者名/発表者名: Sato M, Chi H, Miyoshi K
  • 雑誌名: Xenotransplantation/In Tech ページ: chapter 5
  • 査読あり
• [学会発表] 全ゲノム増幅法による核移植ブタ胚でのgene-targeted allele検出の有効性 (2011)
  • 著者名/発表者名: 池海英、吉田光敏、三好和睦、佐藤正宏
  • 学会等名: 第58回日本実験動物学会総会
  • 発表場所: タワーホール船堀(東京都)
  • 年月日: 20110525-27
• [学会発表] 異種移植関連抗原α-Galエピトープ陰性ブタ体細胞の選択的濃縮のためのtargeted toxinの有効性 (2011)
  • 著者名/発表者名: 池海英、三好和睦、佐藤正宏
  • 学会等名: 第104回日本繁殖生物学会
  • 発表場所: いわて県民情報交流センター・アイーナ(岩手県盛岡市)
  • 年月日: 2011-09-15
• [備考]
  • URL: http://kuris.cc.kagoshima-u.ac.jp
• [備考]
  • URL: http://www2.kufm.kagoshima-u.ac.jp/~mdio/list/e/e3-3/index.html