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PNGaseは糖タンパク質や糖ペプチドからN-型糖鎖を遊離させる酵素であり、糖鎖の構造および機能研究の際の有用な試薬として用いられている。一方、真核細胞の細胞質に広く存在するPNGaseは、異常糖タンパク質の品質管理機構(ERAD)に関わる分子として注目されている。しかしながら、PNGaseの特異な基質特異性から酵素活性を簡便かつ定量的に解析可能な合成基質はなかった。そこで本研究では、PNGase活性を定量的に解析するための合成基質を化学的に調製することを目的とした。また、PNGase活性を細胞内でモニターするための分子プローブとして、FRETをベースとした糖ペプチド型蛍光プローブの開発も合わせて検討した。本年は、1)糖鎖構造の最適化と2)最適ペプチド配列を決定するためにオキシム樹脂によるペプチド固相合成法の検討ならびに、3)蛍光性置換基の導入法の検討を行った。
1)糖鎖構造の最適化を行うために、GlcNAc、キトビオースおよびコア5糖の合成を検討した。得られた糖鎖の還元末端にアジト基を導入し、還元後、クロロアセチル化することにより共有結合型PNGase阻害剤へと導いた。酵素阻害活性をもとにPNGaseの認識糖鎖構造の検証を進めている。2)PNGaseの認識するペプチド配列の最適化を行うためにオキシム樹脂によるペプチド固相合成を検討した。オキシム樹脂の調製およびアスパラギン酸の導入を完了した。現在、ペプチド鎖の伸長と糖ペプチドの合成を検討している。3)クリックケミストリーをベースに蛍光性置換基による糖鎖修飾を検討した。プロパルギル基を有するGlcNAcの合成が完了し、アジト基を有するダンシル誘導体と反応した結果、収率よく蛍光標識されることを確認した。現在、オリゴ糖レベルでの標識化を検討中である。
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