研究課題
生体内でのコンドロイチン硫酸(CS)の代謝に関与するエンド型の分解酵素を同定し、CSの代謝機構およびその調節機構を解明しようとしている。また、その酵素を神経再生医療に応用しようとしている。本年度は以下の研究を行った。1.マウスヒアルロニダーゼ-4(mHyal4)に関する実験:ヒアルロニダーゼ-4の機能研究を行うにあたり、マウスをモデル系として使用するため、mHyal4の解析を行なった。mHyal4遺伝子のクローニングを行い、発現ベクターに遺伝子を組み込み、タグとの融合タンパク質として組換え体タンパク質を得た。組換えタンパク質を、各種グリコサミノグリカン基質に作用させ、酵素反応物をゲルろ過あるいは陰イオン交換クロマトグラフィーによって分析し、CSを特異的に分解したことを確認した。温度、pHなどの条件を変化させて消化反応を行ない、反応の至適条件を決定した。種々のCSバリアントを用いて、詳細な基質特異性を検討した。また、ミカエリス定数Kmと最大反応速度Vmaxを求め、各基質問での親和性を定量的に比較した。さらに、分解産物の構造を質量分析の手法などを用いて決定した。その結果、mHyal4が、ヒトのヒアルロニダーゼ-4よりも広い基質特異性を持つことを明らかにした。さらに、mHyal4のmRNAの発現部位を解析し、精巣など極めて限局された部位にしか発現していないことを解明した。2、ヒトヒアルロニダーゼ-4に関する実験:ヒトヒアルロニダーゼ-4を脊髄損傷の治療など神経再生医療に応用するためには、大量の酵素が必要である。そこで、活性を保持した酵素の酵母での大量発現系の構築を行なった。3、その他の実験:多様な構造をもったCSを得るため、種々の生物由来のCSの構造およびその生物活性を調べた。今年度は特に、エイ軟骨のCSについて解析し、また、新規の抗CS抗体も作製した。これらの成果は、論文として公表された。
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Demonstration of the hepatocyte growth factor signaling pathway in the in vitro neuritogenic activity of chondroitin sulfate from ray fish cartilage.
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