| 研究概要 |
本研究では,ヒトNalm-6細胞を用いたジーンターゲティング法により,さまざまなヒトDNA鎖切断修復遺伝子を系統的に破壊し,得られた変異細胞株(ノックアウト細胞)の表現型解析を詳細に行う.個々の遺伝子の機能を逆遺伝学的に解析することで,さまざまなDNA鎖切断に対する各修復経路の役割を明らかにし,ヒト細胞におけるDNA鎖切断修復機構の全体像を正確に捉えることを目標とする.今年度は,以下の3項目を中心に研究を行った.[1]ヒト遺伝子ノックアウト細胞株の系統的作製:DNA鎖切断修復に関わるヒト遺伝子を系統的にノックアウトし,ホモ変異細胞を作製した.特に,Alternative End-Joiningの実体と役割の解明を目指し、非相同末端連結機構(エンドジョイニング)に異常のある変異株をもとにした二重変異株の作製を系統的に進めた.[2]ヒト遺伝子ノックアウト細胞株の表現型の解析:得られたノックアウト細胞について,増殖速度とコロニー形成率を調べた.また,さまざまなDNA損傷に対する感受性を解析した.損傷誘発剤として,過酸化水素,メチルメタンスルホン酸,ブレオマイシン,ネオカルチノスタチン,カンプトテシン,エトポシド,シスプラチンを主に使用した.感受性試験は,コロニーアッセイ法と増殖阻害アッセイ法により行った,[3]ヒト遺伝子ノックアウト細胞株の組換え能の解析:ヒト変異細胞株におけるランダムインテグレーションとジーンターゲティングの頻度について,HPRT遺伝子座を用いて定量解析を行った.また,非相同末端連結非依存性のランダムインテグレーション機構に関するメカニズム解析を行った.特にベクターの構造や特徴とインテグレーション頻度との相関を網羅的に解析した
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