| 研究概要 |
本研究では,ヒトNalm-6細胞を使用した遺伝子ターゲティング法により,さまざまなDNA鎖切断の修復に関わるヒト遺伝子を系統的に破壊し,得られた変異細胞株の表現型解析を行った.特に,個々の遺伝子の機能を逆遺伝学的に解析することで,さまざまなDNA鎖切断に対する各修復経路の役割を明らかにし,ヒト細胞におけるDNA鎖切断修復機構の全体像を正確に捉えることを目標とした,今年度は,以下の3項目を中心に研究を行った.[1]ヒト遺伝子ノックアウト細胞株の系統的作製:DNA鎖切断修復に関わるヒト遺伝子の系統的なノックアウトを行った.特に,Altern ative End-Joiningの実体と役割の解明を目指し、非相同末端連結(NHEJ)機構に異常のある変異株をもとにした二重変異株の作製を行った.[2]ヒト遺伝子ノックアウト細胞株の表現型の解析:得られたノックアウト細胞について,増殖速度とコロニー形成率を調べるとともに,さまざまなDNA損傷に対する感受性を解析した.損傷誘発剤として,過酸化水素,ブレオマイシン,ネオカルチノスタチン,カンプトテシン,エトポシド,シスプラチンを主に使用した.感受性試験は,コロニーアッセイ法と増殖阻害アッセイ法により行った.[3]ヒト遺伝子ノックアウト細胞株の組換え能の解析:ヒト変異細胞株におけるランダムインテグレーションと遺伝子ターゲティングの頻度について,HPRT遺伝子座を用いて定量的な解析を行った.また,NHEJ非依存性のランダムインテグレーションのメカニズム解析を行った.特にベクターの構造的特徴とインテグレーション頻度との関連に関する網羅的な解析を行った.
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