|
昨年度、申請者は、活性化時に形成されるEGFレセプターの二量体においてレセプター分子同士が相互作用する界面に存在する「二量化アーム」と呼ばれる特徴的なβヘアピン構造に注目し、そのループ構造を模倣した環状ペプチドがEGF刺激によるレセプターの二量化やA431細胞におけるEGFレセプターの自己リン酸化を阻害することを見出した。そこで、本年度は、その環状ペプチドにより強い阻害活性を持たせ、抗肺がん薬開発のリード化合物にまで改良(構造最適化)するための2つのアッセイ手法の開発に取り組んだ。1つは、A431細胞そのものを用いて、細胞表面に発現しているEGFレセプターに対する親和性を直接測定するアッセイ系を確立した。ビオチン化したEGFをアビジンでコートした表面プラズモン共鳴のセンサーチップ表面に固定化し、そこに浮遊化したA431細胞を流すことにより、EGFとの特異的な相互作用を観測することに成功した。また、細胞を流す際に上述の環状ペプチドを添加することによりその相互作用に対するペプチドの影響を評価できることも確認した。もう1つは、キャピラリー電気泳動を用いて、混合物の状態にあるペプチドの親和性を独立に測定できるアッセイ系を確立した。モデル実験では、この手法を用いることにより、ウシ血清アルブミンのプロテアーゼ消化物の中からカルモデュリンという酵素に結合する3つの消化断片を拾い出すことに成功している。今後は、これらのアッセイ手法を適用することにより、EGFレセプター対してより強い阻害活性や親和性を示すペプチドを探索してゆく予定である。また、申請者は、同位体標識を用いて、タンパク質のジスルフィド架橋形成を定量化する手法の開発に成功しており、今後、レセプターとの複合体の構造解析に向けて、この定量化手法をEGF等のリガンドの大量調製へ応用してゆく予定である。
|
