| 研究課題/領域番号 |
21590204
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| 研究機関 | 昭和大学 |
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研究代表者 |
新野 由子 昭和大学, 医学部, 兼任講師 (60398683)
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| 研究分担者 |
塩田 清二 昭和大学, 医学部, 教授 (80102375)
小倉 潔 東京都医学総合研究所, 主任研究員 (70233492)
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| キーワード | 生殖細胞 / プロテインキナーゼC / 精巣 / 精子形成 / PKCデルタ / リン酸化 / 細胞分化 / ノックアウトマウス |
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| 研究概要 |
23年度は、PKCデルタ分子のノックアウトマウスの作出と組織学的解析、培養細胞を用いての本キナーゼのリン酸化基質の探索、PKCデルタVIのモノクローナル抗体の作成を目標とした。
(1)PKCデルタ遺伝子のノックアウトマウス作出。
Cre-loxシステムを組み込んだキメラマウスから、ノックアウトマウス作出のためのホモマウス個体がなかなか生まれて来なかったことと、飼育環境の制限から時間がかかってしまった。2012年3月に、実験に使える数の「Cre-lox-PKCデルタ遺伝子」の子マウスが得られたので、これから全身にCreを発現するマウスとの交配を試みる。
(2)PKCデルタ分子の細胞内基質の探索。
精巣において、最も多く発現しているPKCデルタIVをHEK293細胞に発現させ、TPAで活性化すると、約10分で細胞がroundingする現象が見られる。そこで、PKCデルタIVをHEK293細胞に発現させ、リン酸化されるタンパク質をMS解析により探したところ、核タンパク質のLaminBおよび、Nucleolinが見つかった。また、同細胞からリン酸化タンパク質を精製し、2Dゲルで確認すると、PKCデルタIVを発現していないコントロール細胞に比べ、PKCデルタIVを高発現している細胞ではスポット数が顕著に減り、リン酸化タンパク質の総量が顕著に減少していた。このことはPKCデルタIVの細胞内高発現が、最終的に細胞内での脱リン酸化と細胞のroundingを誘導している可能性を示している。今後PKCデルタIVの直接の基質を確定し、シグナル伝達機構を知ることが重要であるp
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