| 研究概要 |
哺乳類の神経系発生時の、神経細胞が神経突起の萌芽、神経成長円錐の形成、神経突起の伸展などのステップにおける、外界環境からの刺激に応答した神経細胞内の分子応答カスケードのうち、本研究においてはcAMP依存的な制御システムに着目し、青色光によって活性化されるアデニル酸シクラーゼ(PAC)によってACの活性を光のON/OFFで細胞内cAMP濃度を変化させて神経細胞の挙動や形態的変化を観察し、cAMP依存性の細胞機能制御メカニズムを時空間的に高い解像度を持って解析することを最終的な目標としている。
平成21年度には、鞭毛藻類由来のPAC遺伝子(euPACα)の導入発現ベクターを構築した。CMVプロモーターを採用し、IRESを挟んで下流に膜移行シグナルを付与した蛍光タンパク質のtomatoを連結させた。また、PACを免疫化学的に検出するためにHAタグと細胞膜移行シグナルを付与したPAC-Hamの発現ベクターも作成した。これらのベクターをHEK293細胞に導入して光照射による細胞内cAMP濃度の上昇を、ELISA法によって確認した。平成22年度には、この発現ベクターをPC12細胞に導入し、より通常の神経細胞に近い条件で突起萌芽や伸長性の光制御を試みたが、期待される効果は確認されなかった。この問題は遺伝子発現量と分子の活性の低さが原因と考え、より活性化能の高いbPAC (Stierl et al., 2011)の利用と、遺伝子産物の細胞内での安定性を上げる工夫などをして再検討している。同時に、PACによる細胞機能の時空間的光制御システムの一般的な有効性を示すことができる系を神経細胞に限らずに探っている。
マウス胎児海馬由来初代神経細胞培養系への遺伝子導入方法としては、プロモーターにCAGを用い、インビトロジェン社のNeonエレクトロボレーションシステムによって良好の結果を得ている。
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