| 研究概要 |
TGNからリソソームへ輸送される多くの膜貫通タンパク質とのアナロジーを考えた時、β-カテニンが結合できなくなったE-カドヘリンのTGNでの蓄積とリソソームへの輸送にはAP-1A複合体、AP-3A複合体あるいはGGA1, GGA2, GGA3といったクラスリンアダプター分子の関与が考えられた。また、E-カドヘリンの細胞内取り込みはクラスリン依存的に起こるが、多くの膜貫通タンパク質のクラスリン依存性の取り込みにはアダプター分子の内、AP-2複合体の関与が知られている。さらに、E-カドヘリンの側面膜領域への輸送にはAP-1B複合体あるいはAP-4複合体の関与の可能性が考えられた。しかしながら、実際にどれが真に働いているかは全く不明で、全く別のアダプターが機能している可能性も否定できない。
そこで、本年度は、上に挙げたアダプター分子群との結合の有無を詳細に調べることとした。京都大学中山和久先生、理化学研究所大野博司先生から御分与頂いたアダプター分子のcDNAを使って、アミノ末端、カルボキシ末端あるいは分子の中央部にHA, Myc, Flag等のタグを付けた一連のコンストラクトを作製した。これらのコンストラクトを、HEK293細胞で単独であるいは組み合わせてからE-カドヘリンと一過性に発現させ免疫沈降を行った。再三の実験でも特異的な結合は見られなかった。一方、E-カドヘリンの細胞質ドメインをGST融合タンパク質として発現させ、HEK293細胞で発現させたこれらのアダプター分子との結合をGSTプルダウンアッセイにより調べたが、これも特異的な結合は見られなかった。これらの結果から、カドヘリンの輸送に関与するアダプター分子は上に述べた分子群ではないことが判明したので、two-hybrid法を中心に新規のアダプター分子群の検索を行っているがこれまでのところポジティブな結果は得られていない。
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