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昨年度までに、1.ヒトRBP遺伝子で置換したマウス(Rbp^<hRBP>)の作製に成功した。2.TTR遺伝子及びRBP遺伝子がともにヒト化されたヘテロマウス(Rbp^<hRBP>;Ttr^<hV30>及びRbp^<hRBP>;Ttr^<hMet30>)を作製した。具体的には
1.ヒトRBP遺伝子で置換したマウス(Rbp^<hRBP>)の作製
(1)置換アレルを持つESクローンの単離
すでに作製済みの置換ベクター用いて、TT2 ES細胞に電気穿孔法にて導入し、ピュロマイシン耐性クローンを選別した。その後、ランダム挿入ESクローンを除去したのち、最終的には、5'側及び3'側の置換配列領域外の制限酵素を用いてサザンプロット解析を行い、予想したサイズのバンドが検出されたクローンを選択し、置換アレルを持つESクローンと判断した。
(2)置換アレルを持つマウスの作製
上記の置換アレルを持つESクローンを用いて、アグリゲーション法によりキメラマウスを作製した。キメラ率100%のキメラマウスを用いてC57BL/6Jマウスと交配し、子孫から上記と同様にサザンプロット解析によりF1ヘテロマウスを樹立した。Rbp^<hRBP>ヘテロ同士を交配し、PCR法により子孫からホモマウスを選別した。
2.TTR遺伝子及びRBP遺伝子がともにヒト化されたヘテロマウス(Rbp^<hRBP>;Ttr^<hVal30>及びRbp^<hRBP>;Ttr^<hMet30>)の作製(1)Rbp^<hRBP>ホモマウスとTtr^<hVal30>およびTtr^<hMet30>ホモマウスと交配し、子孫から両遺伝子ともに、ヒト化されたヘテロマウス(Rbp^<hRBP>;Ttr^<hVal30>及びRbp^<hRBP>;Ttr^<hMet30>)を得られた。
(2)ヒト化されたホモマウスを得るために、Rbp^<hRBP>;Ttr^<hV30>及びRbp^<hRBP>;Ttr^<hMet30>ヘテロ同士を交配中である。
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