パラフィン包埋切片を用いた遺伝子多重増幅と蛍光ビーズによる変異解析技術の開発

2010 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 21590411
• 研究機関: 地方独立行政法人東京都健康長寿医療センター(東京都健康長寿医療センター研究所)
• 研究代表者: 細矢 博子 地方独立行政法人東京都健康長寿医療センター(東京都健康長寿医療センター研究所), 研究助手 (00158841)
• 研究分担者: 田中 雅嗣 地方独立行政法人東京都健康長寿医療センター(東京都健康長寿医療センター研究所), 研究部長 (60155166) ; 西垣 裕 地方独立行政法人東京都健康長寿医療センター(東京都健康長寿医療センター研究所), 研究員 (80296988) ; 福 典之 地方独立行政法人東京都健康長寿医療センター(東京都健康長寿医療センター研究所), 研究員 (40392526)
• キーワード: 病理解剖 / パラフィン包埋切片 / 生活習慣病 / 脳梗塞 / 動脈硬化 / 健康長寿 / ミトコンドリアゲノム多型 / 遺伝子増幅

研究概要

脳梗塞・動脈硬化など生活習慣病に関連するミトコンドリアDNA多型を解明するために、剖検5164例のパラフィン包埋切片を切り出し、試料を調製した。切片作成ならびにDNA抽出の際に皮膚落屑物および唾液などが混入しないように適切な防止措置を講じた。パラフィン包埋組織切片からのDNA抽出には、古典的なフェノール/クロロフォルム法による抽出を試みたところ、良好な結果を得た。採用した方法の概要をここに記す。(1)パラフィン包埋検体1巻を2mLチューブに移す。(2)抽出用SDS Bufferを400μL添加。(3)100℃,10分加熱後、氷上で5分冷却→vortex。(4)SDS-Proteinase K溶液(抽出用SDS Buffer 100μL+14mg/mL Proteinase K 2μL)添加。(5)vortex後、55℃で3時間保温(6)フェノール/クロロフォルム処理。(7)クロロフォルム処理。(8)イソプロパノール沈殿(楽沈5μL添加)。(6)1/10TE30μlに溶解。パラフィン包埋組織切片から抽出したDNAを鋳型とする場合のPCRは増幅効率が低いので、プライマーの設定は増幅サイズが大きくなりすぎないよう注意した。従来使用していた28-plex PCRは、平均300bp(194-515bp)のDNA断片を増幅するものであったが、パラフィン包埋組織切片から抽出したDNAを鋳型とすると増幅が極めて不良であった。このため、プライマーの設定を全面的に変更し、24対のプライマーを用いて、より短い断片(100bp以下)を増幅した。検討の結果、50ngの総DNAから50回のPCRによって24本の断片を増幅可能であった。96例については凍結腎組織から抽出したDNAを用いて決定したミトコンドリアDNA多型解析の結果とパラフィン包埋切片から抽出したDNAを用いて得られた結果を照合し、信頼性を確認した。

研究成果

• [雑誌論文] Association of a polymorphism of BTN2A1 with dyslipidemia in East Asian populations (2011)
  • 著者名/発表者名: Tetsuo Fujimaki, Kimihiko Kato, Mitsutoshi Oguri, Tetsuro Yohida, Hideki Horibe, Kiyoshi Yokoi, Sachiro Watanabe, Kei Satoh, Yukitoshi Aoyagi, Masashi Tanaka, Hiroto Yoshida, Shoji Shinkai, Yoshinori Nozawa, Dong-Jik Shin, Jong-Ho Lee, Yangsoo Jang, Yoshiji Yamada
  • 雑誌名: Exp Ther Med 巻: 2 ページ: 745-749
  • DOI: DOI:10.3892/etm.2011.266
  • 査読あり
• [雑誌論文] Association of a polymorphism of BTN2A1 with myocardial infarction in East Asian populations (2011)
  • 著者名/発表者名: Yoshiji Yamada, Tamotsu Nishida, Sahoko Ichihara, Motoji Sawabe, Noriyuki Fuku, Yutaka Nishigaki, Yukitoshi Aoyagi, Masashi Tanaka, Yoshinori Fujiwara, Hiroto Yoshida, Shoji Shinkai, Kei Satoh, Kimihiko Kato, Tetsuo Fujimaki, Kiyoshi Yokoi, Mitsutoshi Oguri, Tetsuro Yoshida, Sachiro Watanabe, Yoshinori Nozawa, Aki Hasegawa, Toshio Kojima, Bok-Ghee Han, Younjin Ahn, Meehee Lee, Dong-Jik Shin, Jong Ho Lee, Yangsoo Jang
  • 雑誌名: Atherosclerosis 巻: 215 ページ: 145-152
  • DOI: DOI:10.1016/j.atherosclerosis.2010.12.005
  • 査読あり
• [雑誌論文] Mitochondrial haplogroups A and M7a confer a genetic risk for coronary atherosclerosis in the Japanese elderly : An autopsy study of 1,536 patients (2011)
  • 著者名/発表者名: Sawabe M., et al
  • 雑誌名: J Atheroscler Thromb 巻: 18 ページ: 166-175
  • DOI: 10.5551/jat.6742
  • 査読あり
• [雑誌論文] ミトコンドリア病ならびにシトリン欠損症に対するピルビン酸ナトリウム療法 (2011)
  • 著者名/発表者名: 田中雅嗣
  • 雑誌名: 日本先天性代謝異常学会雑誌 巻: 27 ページ: 77-90
  • DOI: J-GLOBAL ID201202258322091219
• [雑誌論文] Mitochondrial DNA analysis of Hokkaido Jomon skeletons : Remnants of archaic maternal lineages at the southwestern edge of former Beringia (2011)
  • 著者名/発表者名: Adachi N., et al.
  • 雑誌名: Am J Phys Anthropol 巻: 印刷中
  • 査読あり
• [雑誌論文] Importance of mitochondrial haplotypes and maternal lineage in sprint performance among individuals of West African ancestry (2011)
  • 著者名/発表者名: Deason M., et al.
  • 雑誌名: Scand J Med Sci Sports 巻: 印刷中
  • 査読あり
• [雑誌論文] Mitochondrial haplogroups associated with elite Japanese athlete status (2011)
  • 著者名/発表者名: Mikami E., et al.
  • 雑誌名: Scand J Med Sci Sports 巻: 印刷中
  • 査読あり
• [雑誌論文] Beneficial effect of pyruvate therapy on Leigh syndrome due to a novel mutation in PDH E la gene (2011)
  • 著者名/発表者名: Koga Y., et al.
  • 雑誌名: Brain Dev 巻: 印刷中
  • 査読あり
• [雑誌論文] Association of a polymorphism of BTN2A1 with type 2 diabetes mellitus in Japanese individuals (2011)
  • 著者名/発表者名: Hiramatsu M., et al.
  • 雑誌名: Diabetic Med 巻: 印刷中
  • 査読あり
• [雑誌論文] Association of a polymorphism of BTN2A1 with hypertension in Japanese individuals (2011)
  • 著者名/発表者名: Horibe H., et al.
  • 雑誌名: Am J Hypertens 巻: 印刷中
  • 査読あり
• [雑誌論文] Association of polymorphisms of BTN2A1 and ILF3 with myocardial infarction in Japanese individuals with or without hypertension, diabete smellitus, or chronic kidney disease (2011)
  • 著者名/発表者名: Yoshida T., et al.
  • 雑誌名: Int J Mol Med 巻: 27 ページ: 745-752
  • 査読あり
• [雑誌論文] Association of a polymorphism of BTN2A1 with chronic kidney disease in Japanese individuals with or without hypertension or diabetes mellitus (2011)
  • 著者名/発表者名: Yoshida T., et al.
  • 雑誌名: Mol Med Rep 巻: 4 ページ: 511-518
  • 査読あり
• [雑誌論文] Association of a polymorphism of BTN2A1 with chronic kidney disease in Japanese individuals with or without hypertension or diabetes mellitus (2011)
  • 著者名/発表者名: Yoshida T., et al.
  • 雑誌名: Exp Ther Med 巻: 印刷中
  • 査読あり
• [雑誌論文] 人類の遺伝的多様性と運動能力 (2011)
  • 著者名/発表者名: 田中雅嗣
  • 雑誌名: 体育の科学 巻: 61 ページ: 351-356
• [雑誌論文] Extensive screening system using suspension array technology to detect mitochondrial DNA point mutations (2010)
  • 著者名/発表者名: Nishigaki Y, Ueno H, Coku J, Koga Y, Fujii T, Sahashi K, Nakano K, Yoneda M, Nonaka M, Tang L, Liou CW, Paquis-Flucklinger V, Harigaya Y, Ibi T, Goto Y, Hosoya H, DiMauro S, Hirano M, Tanaka M
  • 雑誌名: Mitochondrion 巻: 10 ページ: 300-308
  • DOI: DOI:10.1016/j.mito.2010.01.003
  • 査読あり
• [雑誌論文] Metabolic analysis of 13C-labeled pyruvate for noninvasive assessment of mitochondrial function (2010)
  • 著者名/発表者名: Wu IC, Ohsawa I, Fuku N, Tanaka M
  • 雑誌名: Ann N Y Acad Sci 巻: 1201 ページ: 111-120
  • DOI: DOI:10.1111/j.1749-6632.2010.05636.x
  • 査読あり
• [雑誌論文] Trehalose extends longevity in the nematode Caenorhabditis elegans (2010)
  • 著者名/発表者名: Honda Y., et al.
  • 雑誌名: Aging Cell 巻: 9 ページ: 145-152
  • 査読あり
• [雑誌論文] Mitochondrial haplogroups associated with lifestyle-related diseases and longevity in the Japanese population (2010)
  • 著者名/発表者名: Nishigaki Y., et al.
  • 雑誌名: Geriatr Gerontol Int 巻: 10Suppl 1 ページ: S59-S69
  • 査読あり
• [雑誌論文] Redox regulation, gene expression and longevity (2010)
  • 著者名/発表者名: Honda Y., et al.
  • 雑誌名: Geriatr Gerontol Int 巻: 10Suppl 1 ページ: S59-S69
  • 査読あり
• [雑誌論文] Extensive screening system using suspension array technology to detect mitoclaondrial DNA point mutations (2010)
  • 著者名/発表者名: Komaki H., et al.
  • 雑誌名: Biochim Biophys Acta 巻: 1800 ページ: 313-315
  • 査読あり
• [雑誌論文] Extensive and rapid screening for major mitochondrial DNA point mutations in patients with hereditary hearing loss (2010)
  • 著者名/発表者名: Kato T., et al.
  • 雑誌名: J Hum Genet 巻: 55 ページ: 300-308
  • 査読あり
• [雑誌論文] Loss of mutant mitochondrial DNA harboring the MELAS A3243 Gmutation in human cybrid cells after cell-cell fusion with normal tissue-derived fibroblast cells (2010)
  • 著者名/発表者名: Yano T., et al.
  • 雑誌名: Int J Mol Med 巻: 25 ページ: 153-158
  • 査読あり
• [雑誌論文] ミトコンドリアゲノム多型と健康・長寿 (2010)
  • 著者名/発表者名: 福典之・田中雅嗣
  • 雑誌名: 公衆衛生 巻: 9 ページ: 754-760
• [学会発表] Mitochondrial DNA in human longevity and in age-associated diseases (2010)
  • 著者名/発表者名: Tanaka M.
  • 学会等名: The 6th Conference of Asian Society of Mitochondrial Research and Medicine
  • 発表場所: Fukuoka
  • 年月日: 2010-12-17
• [学会発表] ピルビン酸療法 (2010)
  • 著者名/発表者名: 田中雅嗣
  • 学会等名: 第52回日本先天性代謝異常学会
  • 発表場所: 大阪
  • 年月日: 2010-10-22
• [学会発表] Mitopenia contributes to sarcopenia, osteopenia, diabetes, and metabolic syndrome : Practical approaches to verify this hypothesis (2010)
  • 著者名/発表者名: Tanaka M.
  • 学会等名: The 12th Asian-Pacific Conference of Clinical Biochemistry
  • 発表場所: Seoul
  • 年月日: 2010-10-04
• [学会発表] ミトコンドリアと光感受性 (2010)
  • 著者名/発表者名: 田中雅嗣
  • 学会等名: 第32回日本光医学・光生物学会
  • 発表場所: 東京
  • 年月日: 2010-07-31
• [備考]
  • URL: http://mtsnp.tmig.or.jp/mtsnp/index.shtml