研究課題
昨年度の研究結果から、T. cruzi感染細胞では活性酸素種産生が行われ、宿主アポトーシス抑制因子c-FLIPがnitorosylationされることが明らかとなった。この反応は可逆的であるため、結合したNOがサンプル調整中にはずれてしまう可能性が考えられた。そこで、nitosylationされたタンパク質が安定に検出できる方法を検討した。感染細胞ライセートにSDSを加えたサンプルバッファーを添加すると、NOがはずれてしまうことがわかり、種々の条件を検討した。また、c-FLIPと相互作用する原虫側の因子を探索するため、c-FLIP発現細胞の樹立を試みた。しかしながら、c-FLIP全長を発現させるのが困難であったため、N末側のDED領域とC末側のpseudo-caspase領域を含む領域をPCRで増幅し、動物細胞発現ベクターに連結した。その遺伝子をHT1080細胞にトランスフェクションし、pseudo-caspase領域を発現した細胞のクローン化を行った。Pseudo-caspaseはmycおよび4F:LAGのtag付タンパク質として発現され、ウエスタンブロットで確認したところ予想したサイズのバンドが検出され、発現細胞の樹立に成功した。DED領域発現細胞については現在クローン化を行っているところである。発現細胞を用いて、原虫と相互作用するタンパク質を探索したが、サンプル調整の際に結合がはずれてしまう可能性が考えられた。そこで、pseudo-caspase発現細胞にT. cruziを感染させ、UVクロスリンクを行った後にライセートを作製した。原虫感染および非感染発現細胞からUVクロスリンク後にそれぞれライセートを調整し、myc抗体を用いて免疫沈降を行い、SDS電気泳動およびウエスタンブロット法を用いてc-FLIPのpseudo-caspase領域と相互作用するタンパク質の検出を試みている。UV照射量、照射時間について条件検討を行い、実験系を確立中である。
すべて 2011
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