| 研究概要 |
本研究は2つの蛍光probeを近接するRNAと反応させ、energy transfer technologyを使用することで、RNAを細胞内で同定しようとするものである。Probe得られた至適donor probeとacceptor probeに、アビジン蛋白を結合させ、導入される色素probeの分子量の設定を試みた。数種類の蛍光物質を使用し指摘な蛍光probeを作成した。核膜を透過せず胞体内に局在し、目標とするRNAと反応する、至適donor probeとacceptor probeの設定が必要とされる。低分子の蛍光probeでは非特異反応が多く、比較的高分子の蛍光probe作成が必要であった。KRAS mRNAに対し作製されたprobeの特異性を確認した。培養細胞にdonorおよびacceptor probeとincubateし、KRAS mRNA高発現細胞でFRET蛍光が上昇することをスペクトロメーター等により解析した。この結果、特異的な蛍光が観察されたが、、KRAS以外の100,000コピー以下のRNAを標的とした場合十分に蛍光が増強せず、蛍光感度を現在よりも上げる工夫が必要であった。一方で、癌細胞を生きたまま、特異的RNAの発現の有無より分離する方法を検討した。蛍光probeの白血病細胞への導入とgatingとsortingによる分離効率の調整、そして生細胞率の向上をねらった。これまでの検討では生細胞率と導入効率は逆相関があり、K562やNB4を使用した場合は導入効率が70%以上となったが、正常人末梢血のリンパ球ではprobeの導入効率が悪く、導入効率を高めることにより生存率が低下することが判明した。さらにprobeの導入技術の向上をはかっていく必要がある。
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