| 研究概要 |
我々は、作年度に肝細胞癌(肝癌)において、腫瘍ダイナミクスを早期に反映する新規マーカーとして、血清中より癌特異的なAPC, CDKN2A, GATP1, RASSF1のメチル化DNAの検出、定量が有用である可能性を見いだした。本年度は、APC遺伝子のメチル化DNAと非メチル化DNAの割合(Me/NMe DNA比)を、血清中の遊離DNAから高感度に検出、判定するため、APCプロモーターのCpG islandに、Bisulfite処理後のDNAがメチル化の状態に関わらず増幅されるPCRプライマーを設定し、さらにその内部にメチル化、非メチル化DNAをそれぞれ特異的に増幅、検出するhemi-nested TaqManプライマー,プローブを設定することにより、1 stepで高感度にMe/NMe DNA比の定量的解析が可能な系を開発した。肝癌組織DNAを希釈し、このアッセイ系でMe/NMe DNA比を求めたところ、希釈前のDNAを用いたCOBRA法の結果とよく一致した。次に、肝癌症例および正常者の血清100μ1よりDNAを抽出、Bisulfite処理し、上記の方法でMe/NMe DNA比を求めたところ、肝癌症例の血清では全例で検出が可能であり、一方、正常者では血清中にMe-DNAは検出されなかった。また肝癌症例でのMe/NMe DNA比と腫瘍の脈管浸潤との間には有意な相関が観察された。このMe/NMe DNA比は肝癌の分指標的療法の経過中にAFPよりも早期に低下し、また再発時にはAFPよりも早期に上昇した。すなわち、微量血清より、高感度に腫瘍由来DNAに対する非腫瘍由来DNAの比率を求めるアッセイ系を確立し、腫瘍の増殖状態ではこの比率が上昇し、非増殖状態では低下することを示した。
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