| 研究概要 |
1.WT1遺伝子の強発現および発現抑制による肝細胞宿主細胞遺伝子の変化
肝細胞癌株(Huh7,Huh7.5.1,HLE)においてWT1発現プラスミドをトランスフェクションしてWT1遺伝子を強発現し、またWT1 siRNAをトランスフェクションしてWT1発現を抑制して宿主細胞遺伝子の変化を確認した。PCRアレイを用いた網羅的解析により、特にアポトーシスに関わる遺伝子群に変化が見られた。フローサイトメトリーを用いたAnnexin V染色によるアポトーシスアッセイで、WT1発現抑制によるアポトーシス細胞の増加が見られた。
2.WT1による抗アポトーシス作用とその機序についての解析
アポトーシス関連遺伝子のPCRアレイにより、WT1はデスシグナルを修飾することが明らかになった。さらに、アポトーシスに関連する宿主細胞内蛋白の発現、mRNAのreal-time RT-PCRによる定量により、WT1抑制によるCaspase 3, 8, 9蛋白発現増加と、mRNA発現増加を確認した。その機序について、今後シグナル伝達系のどの部分に作用して抗アポトーシス作用を有しているのか、その詳細について検討する予定である。
3.複数のHCV複製系の確立によるC型肝細胞癌モデルの作成とHCV発現によるWT1遺伝子発現変化の検討
HCV genotype 1a株であるH77を用いたHCV複製系をHuh7,HepG2の他に、HLEにおいても確立した。また、このHCV複製系に加えて、HCV genotype 2a株であるJFH-1およびHuh7.5.1細胞を用いたHCV粒子生成可能複製系を立ち上げた。遺伝子導入後のHCV-RNAの立ち上がりをstrand specific RT-PCRで、またHCV core蛋白の増加をELISAにて確認している。さらに、H77-sを用いたHCV genotype 1aの粒子形成可能な複製系を立ち上げている。これら複数のHCV複製系を用いたWT1とHCV、さらにPKRなどHCV関連遺伝子の変化についてPCRアレイを用いて網羅的に解析している。
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