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内皮細胞には膜陥入構造であるカベオラが豊富に存在し、そこには主要な構造蛋白であるcaveolin-1の他、GPCR、PLC、Ca^<2+>ポンプ、eNOSなどCa^<2+>調節に関連する分子が集中する。我々は、遊走中の内皮細胞においてcaveolin-1分布が極性を持つこと、またATP刺激に対して細胞辺縁のcaveolin-1集中部位からCa^<2+> waveが発火し、細胞全体へと伝搬することを以前報告した。本研究では、caveolin-1集中部位がCa^<2+> waveの発火点となる機構を更に詳細に検討するために、細胞内局所IP_3産生とCa^<2+>ストアである小胞体(ER)内Ca^<2+>の動態をイメージングにより解析した。
培養ウシ大動脈内皮細胞にCa^<2+>センサー蛋白や蛍光蛋白を一過性に発現させてCa^<2+>シグナルの時空間的パターンとカベオリンの細胞内局在との関連を検討した。生細胞におけるカベオリン局在は内因性caveolin-1と共局在するTagRFP融合caveolin-1をマーカーとした。細胞内Ca^<2+>はGCAMP-3の蛍光変化により、また小胞体ER内Ca^<2+>はカメレオン蛋白変異体であるD1ERを用いてFRETイメージングにより解析した。細胞内局所のIP_3産生は、PLC δ PH領域とGFPの融合蛋白の膜から細胞内への移行によって評価した。
ATP刺激によるCa^<2+> waveの開始は既報通り細胞内caveolinの集中する辺縁の一部より開始する。同部位はIP_3産生の開始部位でもあり、そこからIP_3 waveとして細胞全体に伝搬することが確認された。また、局所ERの細胞内Ca^<2+>減少は同部位から強く開始された。更に、細胞外Ca^<2+>フリーでは細胞内ER全体で低下したストアCa^<2+>がER内でcaveolin集中部位の局所に優先的に補充される事が観察され、ER内のCa^<2+> flowによりCa^<2+>シグナルの時・空間的調節を修飾していることが明らかとなった。
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