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6週齢のSDラットに片腎摘出術を行い、その1週間後に(1)コントロール群、(2)高食塩食群(8%NaCl)、(3)アルドステロン投与群(0.75μg/h、浸透圧ポンプ)、(4)アルドステロン+高食塩食群の4群に分け、4週間飼育後に堵殺して腎組織からタンパク質を抽出した。抽出したタンパク質をセリンプロテアーゼに対する合成基質(QAR-MCA)を用いたDouble Layer Fluorescent Zymography法(DLFZ法)により解析し、アルドステロン+高食塩食群において特異的に活性が亢進する分子量約70kDaのセリンプロテアーゼを同定した。次に腎臓抽出タンパク質をイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィーにより粗精製し、先のDLFZ法によって同定した酵素活性を指標にしながら目的のセリンプロテアーゼの粗精製分画を得た。そのタンパク質を1D gelを用いて分離し、shotgun LC-MS/MS法により解析した。以上の一連の操作により、アルドステロンと高食塩食によって酵素活性が亢進するセリンプロテアーゼとして、70kDaのタンパク質の同定に成功した。そのタンパク質に対する抗体を作成し、ウエスタンブロット法でもセリンプロテアーゼ発現の亢進を確認できた。そのセリンプロテアーゼのKOマウスは生後すぐからの腎障害が強いため、実験に用いることが出来なかったが、そのセリンプロテアーゼに対する阻害薬を用いた実験において、アルドステロンと食塩による腎障害の著明な軽減が認められた。すなわち、今回同定したセリンプロテアーゼがアルドステロンと食塩によって惹起される腎障害に深く関与していることが示唆され、その阻害薬が今後臨床的に応用されることが期待される。
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