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(1)運動ニューロンと変異型SOD1アストロサイトの共培養において、コントロールアストロイトとの共培養と比較して発現量が変化するcDNAのリストを作製した。具体的には胎齢12.5日のマウス胎仔脊髄から初代培養した運動ニューロン(MN)と変異型SOD1(G93ASOD1AST)あるいは野生型SOD1アストロサイト(WTSOD1AST)の共培養からmRNAを抽出した。mRNAをcDNAに逆転写後、サブトラクション法を用いて発現量が増減するcDNAのリストを作製し、BLASTで遺伝子を同定した。
(2)発現量が増加したmRNAは134あった。続いて変異SOD1(G93A)DNAを導入したALSマウスおよびコントロールマウス脊髄からmRNAを抽出し、(1)のcDNAの一部をプローブとして、ノザンブロッティングあるいは定量的RT-PCRを行い、組織で発現量が増加しているcDNAを選択した。発現レベルが増加しているmRNAについてはALSマウス脊髄を用いてin situ hybridizationを行い、発現細胞を同定した。
(3)(2)で同定したcDNAの全長をRT-PCRを用いて取り出し、タンパク発現ベクターにサブクローニングを行った。またその中から特にモデルマウス脊髄で発現量の多かった遺伝子Aについてトランスジェニックマウスを作成した。
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