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本年度の研究は、CIN85 RNAi loxPベクタートランスジェニックマウスの作成を集中して行った。
まずはこのマウス作成のための新規ベクターだが、宮崎純一教授(阪大)より供与いただいたCAG promoter-loxP-CAT(終止配列)-loxP-EmGFPベクターをバックボーンにloxP-EmGFP下流にマウスCIN85(mCIN85)RNAi配列を挿入し、Cre recombinase発現によりloxPに囲まれたCAT-終止配列が除かれた際、CIN85 RNAi発現がGFP発現によりモニターできるように構築した。尚、このベクターのCIN85 RNAi配列部位はスクリーニング実験で単独でノックダウン効率の高かった配列をタンデムで2つ連結したものであり、この方法により単独以上のノックダウン効率を確認している。次に上記ベクターが実際に機能することをin vitroで確認するために、このベクターとCre発現ベクターを共にマウスA20細胞(B細胞株)に導入したところ、コントロールに比してCIN85発現がmRNAならびに蛋白レベルで80%以上抑制されることを確認した。こうして質の確認できたベクターを至適部位にて切断しlinealizeした後に受精卵にマイクロインジェクションを行い、その後breedingを重ねた結果、F1マウスのgenotypingにてGFP陽性を認めgerminal transmissionがうまくいっていることを確認した。
今後、さらにbreedingを重ねてgenotypingにてGFP陽性マウスを選択し、これらのマウスとCre発現マウスとの交配にてCIN85をin vivoでノックダウンする系が確立する。
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