| 研究課題/領域番号 |
21591521
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| 研究機関 | 香川大学 |
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研究代表者 |
中村 祐 香川大学, 医学部, 教授 (70291440)
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| 研究分担者 |
伊藤 康一 徳島文理大学, 薬学部, 教授 (30291149)
森 俊雄 奈良県立医科大学, 医学部, 准教授 (10115280)
亀井 聖史 香川大学, 医学部附属病院, 助教 (60437671)
熊 宏美 香川大学, 医学部附属病院, 助教 (90464362)
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| キーワード | オリゴデンドロサイト / 分化 / NER / PDGF / NT-3 / UV / 無血清 / 修復 |
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| 研究概要 |
無血清培地における各分化段階にあるラット初代オリゴデンドロサイトを培養する系の確立を行った。ジエチルエーテル麻酔下で妊娠16日目のラットの胎児より大脳部分を取り出す。脳膜を実体顕微鏡下で丁寧に剥離した後、DNase,Trypsin存在下で細胞を分散させた。メッシュを通した後、ガラスボトムディッシュ(PLLコート)に細胞を播き、10%FBS(DMEM)の培地にて培養を行った。2度のパッセージの後、無血清培地に移行し、分化誘導を行った。PDGF、NT-3について投与の時期、期間について詳細に検討し、分化したオリゴデンドロサイトが最も安定する条件を決定した。分化したオリゴデンドロサイトの検討は、抗PDGFα抗体、抗NG-2抗体、抗O1抗体、抗O4抗体、抗MBP抗体による免疫細胞化学染色を行い、形態と染色性の両面から検討した結果、純度の高いラット初代オリゴデンドロサイトを培養することが可能となった。
樹立した各分化段階にあるラット初代培養オリゴデンドロサイトにUVを照射した(0-10J/m^2)。4%フォルマリンにて固定を行い、Triton X-100を含むPBSにて浸透化処理後、抗MBP抗体、抗GFAP抗体、および抗6-4PP抗体を1次抗体として免疫細胞蛍光染色を行った。核DNA蛍光量あたりの6-4PP蛍光量(100細胞以上)を、照射直後、および各修復時間サンプルにおいて計算し、各分化段階にあるオリゴデンドロサイトの6-4PP修復能すなわちNER活性を測定し、オリゴデンドロサイトの分化に伴う修復能力の変化について検討した結果、NER活性は細胞分化により変化することが示唆された。
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