| 研究課題/領域番号 |
21591572
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| 研究機関 | 横浜市立大学 |
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研究代表者 |
中神 佳宏 横浜市立大学, 医学部, 助教 (80347301)
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| 研究分担者 |
大村 素子 横浜市立大学, 医学部, 准教授 (70244506)
井上 登美夫 横浜市立大学, 医学研究科, 教授 (80134295)
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| キーワード | siRNA / 遺伝子発現イメージング / 99mTc / poly-A-polymelase / 293T細胞 |
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| 研究概要 |
個体における遺伝子発現を非侵襲的にリアルタイムで画像診断することができれば、病気の分子診断法としても、あるいは治療効果の判定法としても、従来にない画期的なツールになるものと期待され、本研究はその基礎的データを提供するものと期待される。
本年度ではまず、siRNAを応用した遺伝子発現イメージングに関し、in vitroの条件における基礎的データを解析した。
まず、293T細胞を液体培地上で培養後、それぞれの細胞群の対数増殖期にLacZ遺伝子を強制発現させるベクターを用いてLacZ遺伝子を過剰発現する293T細胞を作成した。対照群として、そのベクターを用いていない細胞系列を用いた。一方、LacZ遺伝子を特異的にノックダウンするように設計したsiRNA合成を業者に委託しそのsiRNAに対し99mTcを標識した。標識方法は当教室で開発した手法(poly-A-polymelaseを用いる方法)を用いることによりsiRNAの3'末端のみに特異的に標識した。そして、LacZ遺伝子高発現細胞群と低発現細胞群のそれぞれに等量の標識siRNAを加え一定時間(30分～6時間)37℃、5%CO2中でインキュベートした。
そして、それぞれの細胞群から培地を取り除き、PBSで3回wash、細胞溶解バッファーを用いてwhole cell lysateを取り出し放射能カウントを測定した。またそれぞれの総タンパク濃度をBCA法により測定し、単位タンパク量(細胞数に比例)当りのカウントに換算し放射能を比較した。すると、LacZ遺伝子高発現細胞群の方がと低発現細胞群に比べ放射能が高かった。この結果は、遺伝子特異的に99mTc標識siRNAが結合していることを示唆している。
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