| 研究課題/領域番号 |
21591982
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| 研究機関 | 名古屋市立大学 |
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研究代表者 |
藤田 義人 名古屋市立大学, 大学院・医学研究科, 講師 (90238593)
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| 研究分担者 |
浅井 清文 名古屋市立大学, 大学院・医学研究科, 教授 (70212462)
祖父江 和哉 名古屋市立大学, 大学院・医学研究科, 教授 (90264738)
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| キーワード | 水チャンネル / 脳浮腫 / ノックダウン / アクアポリン / 脳低温 / RNAi |
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| 研究概要 |
今後の研究の基礎とるアクアポリン(AQP) Knockdown細胞株の確立を重点に行った。
Knockdownが確認されているconstructを作成したうえ、vectorに導入した。shRNAを発現するvectorには、神経系の細胞のRNAiで定評のあるinvitrogen社製のBlock-IT Pol II miR RNAi expression vector、 pcDNA6.2-GW/miRを使用した。そのプラスミドを大腸菌にtransformationして、大量培養し、Quiagen社のキットを用いて、目的となるconstructを含むプラスミドを大量に、無菌的に精製した。
アストロサイトにtrasnfectionする方法として、リポフェクションを利用した、Trans-IT Neuralを使用した。ただ、transfectionをおこないRNAiのの効率が非常に悪く、10%以下となっている。このことに関して、transfection効率の最もよくなると考えられる条件を、mediumの組成や、transfection reagentの量、vectorの量などの最適条件を検討中した。ウエスタンでRNAiの効果を確認するが効果が弱く、原因が(1) transfectionの効率が悪い(2)実際のRNAiがうまくいっていないかはっきりわからなかった。そこで、その原因追求のため、transfection効率を視覚的に確認するためvecterにGFPをつけることを試みた。GFPをvectorに挿入した。そしてGFPをつけたvectorを大量制作した。
そのGFPつきのvectorの挿入で、視覚的におおざっぱにいって20%ぐらいのtransfection効率があることを確認した。ただRNAi効果をえる効率は、まだ10%程度にとどまった。transfection効率をあげるためレンチウイルスを使用したvectorの作製を進めると同時に、現在作成してあるGFPつきvectorを用い。実際の低温における脳浮腫効果の解明を始めている。
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