| 研究課題/領域番号 |
21591982
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| 研究機関 | 名古屋市立大学 |
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研究代表者 |
藤田 義人 名古屋市立大学, 大学院・医学研究科, 講師 (90238593)
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| 研究分担者 |
浅井 清文 名古屋市立大学, 大学院・医学研究科, 教授 (70212462)
祖父江 和哉 名古屋市立大学, 大学院・医学研究科, 教授 (90264738)
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| キーワード | 水チャンネル / 脳浮腫 / ノックダウン / アクアポリン / 脳低温 / RNAi |
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| 研究概要 |
今後の研究の基礎とるアクアポリン(AQP)Knockdown細胞株の確立を重点に行った。
Knockdownが確認されているconstructを作成したうえ、vectorに導入した。アストロサイトにtransfectionする方法として、リポフェクションを利用した、Trans-IT Neuralを使用した。ただ、transfectionをおこないRNAiのの効率が非常に悪く、10%以下となっている。このことに関して、transfection効率の最もよくなると考えられる条件を、mediumの組成や、transfection reagentの量、vectorの量などの最適条件を検討中した。ウエスタンでRNAiの効果を確認するが効果が弱く、原因が(1)transfectionの効率が悪い(2)実際のRNAiがうまくいっていないかはっきりわからなかった。そこで、その原因追求のため、transfection効率を視覚的に確認するためvecterにGFPをつけることを試みた。GFPをvectorに挿入した。そしてGFPをつけたvectorを大量制作した。
そのGFPつきのvectorの挿入で、視覚的におおざっぱにいって20%ぐらいのtransfection効率があることを確認した。ただRNAi効果をえる効率は、まだ10%程度にとどまった。試行錯誤の結果、現段階ではこれ以上効率をあげることは難しいと考えられた。その解決策として、transfection効率をあげるためレンチウイルスを使用したvectorの作製を進めることを検討中である。また、現在作成してあるGFPつきvectorで、実際の低温における脳浮腫効果の解明を始めている。さらに、AQP4を発現する適当なcell lineを探し、現在作成されているconstructの入ったvectorを使用して、AQP4をkockdownできているcell lineの確立を試みている。Cell lineが確立できれば低温などの条件を付加して、低酸素に対する予防を行う予定である。
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