| 研究課題/領域番号 |
21591982
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| 研究機関 | 名古屋市立大学 |
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研究代表者 |
藤田 義人 名古屋市立大学, 大学院・医学研究科, 講師 (90238593)
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| 研究分担者 |
浅井 清文 名古屋市立大学, 大学院・医学研究科, 教授 (70212462)
祖父江 和哉 名古屋市立大学, 大学院・医学研究科, 教授 (90264738)
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| キーワード | 水チャンネル / 脳浮腫 / ノックダウン / アクアポリン / 脳低温 / RNAi |
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| 研究概要 |
研究の基礎とるアクアポリン(AQP)Knockdownとoverexpression細胞株の確立を重点に行った。
RNA interferenceによるknockdownが確認されている配列をもとに、ShRNAを発現するvectorを作成したうえ、vectorに導入した。アストロサイトにtransfectionする方法として、リポフェクション(Trans-IT Neural)を使用した。Transfection効率を視覚的に確認できるGFPつきのvectorの挿入で、視覚的に約20%程度のtransfection効率であることを確認した。ただRNAi効果を得る効率は、まだ10%程度にとどまった。試行錯誤の結果、現段階ではこれ以上効率をあげることは難しいと考えられた。その解決策として、transfection効率を上げるためレンチウイルスを使用したvectorの作製を進めている。
AQP4のoverexpression細胞株の確率のため、hAQP4-M23およびhAQP4-M1を発現するラット星状膠細胞であるC6の作成を試みた。可視化のためVenusを挿入したpCAGIPuro-hAQP4-Venus vectorをM1およびM23それぞれ作成し,ラット星状膠細胞であるC6に、Lipofectamine2000を用いて、形質導入した。蛍光顕微鏡で蛋白発現を確認し、ウエスタンブロッティングでも蛋白発現を確認した。また、hAPQ4-M23に関しては、permanent cell lineを、蛍光顕微鏡の蛋白発現と、ウエスタンブロッティングでの蛋白発現の確認を終え、完成させた。現在、hAPQ4-M1のpermanent cell lineの作成に取り組んでいる。
また、現在作成してあるGFPつきvectorで、実際の低温における脳浮腫効果の解明を始めている。さらに、AQP4を発現する適当なcell lineを探し、現在作成されているconstructの入ったvectorを使用して、AQP4をknockdownできているcell lineの確立を試みている。Cell lineが確立できれば低温などの条件を付加して、低酸素に対する予防を行う予定である。
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