| 研究課題/領域番号 |
21592077
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| 研究機関 | 名古屋市立大学 |
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研究代表者 |
畦元 将隆 名古屋市立大学, 大学院・医学研究科, 研究員 (70264736)
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| 研究分担者 |
水野 健太郎 名古屋市立大学, 大学院・医学研究科, 研究員 (70448710)
中根 明宏 名古屋市立大学, 大学院・医学研究科, 研究員 (70464568)
郡 健二郎 名古屋市立大学, 大学院・医学研究科, 教授 (30122047)
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| キーワード | 再生医学 / 胚性幹細胞 / 遺伝子導入 / 分化実験 / RT-PCR |
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| 研究概要 |
Pax2遺伝子導入ES細胞を培養し、分化させ、尿細管などの腎構成細胞やその幹細胞を誘導できる至適な培養条件、時間を検討し、移植に必要な細胞を準備した。
1.遺伝子導入ES細胞の確立と培養
マウスより確立されたES細胞の一つであるMGZRTcH2細胞を用いた。培養条件は5%CO2、 37℃で、培養液はGlasgow MEMに10% FCS、 10-4M 2-メルカプトエタノール、non-essential aminoacid、 1mM sodium pyruvate、 1000U/ml LIFを加えたもの使用する。ES細胞を回収し、Pax2遺伝子を組み込んであるプラスミドDNAを用意し、960μF、 250mVの条件でelectropolation法を行い、遺伝子を導入した。
2.遺伝子導入ES細胞の分化実験
Pax2遺伝子導入ES細胞をLIFを除いた培養液中でhanging drop法を用いembryoid body(胚様体:EB)を形成させ、分化させた。5日後にEBを再度ディッシュに付着させ、分化を進めて、時間の経過とともに細胞を回収し、発現してくる遺伝子に変化がないかどうかをRT-PCR法を用い確認した。また細胞の形態変化なども評価した。
3. Pax2遺伝子導入ES細胞およびEBの遺伝子発現の確認
回収したPax2遺伝子導入ES細胞、細胞塊をまず導入遺伝子自体が発現しているかどうかをRT-PCR法を用い確認した。ディッシュに平面培養したES細胞を回収し、mRNAを抽出し、SuperScript IIIキットにて逆転写反応を行った。得たcDNAでPCR反応を行い、この時、遺伝子未導入ES細胞を対照とし、増幅DNAバンドの有無などで判断した。同様に他の腎発生の各段階で発現してくる遺伝子に変化がないかどうかをRT-PCR法を用い確認し、AQP1、 Integrin α8の上昇を認めた。
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