| 研究課題/領域番号 |
21592077
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| 研究機関 | 名古屋市立大学 |
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研究代表者 |
畦元 将隆 名古屋市立大学, 大学院・医学研究科, 研究員 (70264736)
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| 研究分担者 |
水野 健太郎 名古屋市立大学, 大学院・医学研究科, 助教 (70448710)
中根 明宏 名古屋市立大学, 大学院・医学研究科, 研究員 (70464568)
郡 健二郎 名古屋市立大学, 大学院・医学研究科, 教授 (30122047)
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| キーワード | 再生医学 / 胚性幹細胞 / 遺伝子導入 / 分化実験 / RT-PCR |
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| 研究概要 |
ES細胞から腎臓への分化誘導系を確立することを最終目的に、Pax2遺伝子をES細胞に遺伝子導入をし、目的の細胞に分化する可能性のある遺伝子導入ES細胞を前年度までに確立した。さらにそのES細胞を用いて腎発生機構を明らかにするために培養条件を検討し、条件の違いにより発現する遺伝子の違いが明らかになった。
1.Pax2遺伝子導入ES細胞およびEBの遺伝子発現の確認
回収したPax2遺伝子導入ES細胞、細胞塊をまず導入遺伝子自体が発現しているかどうかをRT-PCR法を用い確認する。ディッシュに平面培養したES細胞を回収し、mRNAを抽出し、SuperScript IIIキットにて逆転写反応を行った。得たcDNAでPCR反応を行った。この時、遺伝子未導入ES細胞を対照とし、増幅DNAバンドの有無などで判断した。他の腎発生の各段階で発現してくる遺伝子に変化がないかどうかをRT-PCR法を用い確認し、尿細管において水輸送に重要な働きをするAQP1と、腎発生で重要な働きをするIntegrin α8の上昇を認めた。
2.Pax2遺伝子導入ES細胞およびEBのマウスへの移植
上記実験で得たES細胞およびEBを免疫不全マウスであるSCIDマウスの腎被膜下に移植を行った。今回の検討ではteratomaの形成を認めた。HE染色、免疫染色において移植組織内の明らかな腎組織を認めなかった。
3.新規培養条件の検討
糸球体構成細胞を形成させる培養条件を検討した。Activin A、レチノイン酸添付により、RT-PCRにおいて足細胞のマーカーであるPodcinの上昇を確認できた。
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