| 研究課題/領域番号 |
21592223
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| 研究機関 | 浜松医科大学 |
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研究代表者 |
大坪 正史 浜松医科大学, 光量子医学研究センター, 助教 (10327653)
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| 研究分担者 |
大石 健太郎 浜松医科大学, 光量子医学研究センター, 助教 (80345826)
細野 克博 浜松医科大学, 医学部, 助教 (60402260)
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| キーワード | 緑内障 / 相互作用タンパク / 遺伝子 / シグナル伝達 / 神経科学 / プロテオーム / 生体分子 |
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| 研究概要 |
緑内障原因遺伝子オプチニュリン(OPTN)は視神経変性への開与が想定される重要な遺伝子である。しかし、生体での機能は十分に明らかではない。本研究では、これまでに既に見出しているOPTN相互作用タンパクについて、関わる発症機序を探ると共に、in utero遺伝子導入法による機能破壊で、緑内障臨床症状との関連を検証する。
本年度は、OPTN相互作用タンパクについて、細胞系での機能解析が進んだ。相互作用タンパク遺伝子の、クローニング・変異導入を行った。遺伝子導入による発現と細胞内局在確認、共免疫沈殿による相互作用の確認を実施した。核移行など幾つかの機能解析について以下に例示する。
1.核移行に関する検討:部分断片型OPTN発現ベクターとY2H法を用いて、相互作用部位を大まかに決定した。核移行関連タンパクのN端部への強い結合を検出した。また、OPTNのゴルジ装置への局在に寄与するタンパクの恒常的活性化変異体ではOPTNとの結合が減弱することを確認した。
2.Ub化の検討:前項と同様の手法で、UbのOPTN C端部への結合を検出した。OPTNと機能類似性を示すタンパクとのアミノ酸配列比較で、保存領域を明らかにした。患者で同定されているOPTN変異(A)周辺領域が、Ubとの結合に必須であった。
3.タンパク品質管理系の検討:培養細胞においてある特定のタンパク遺伝子とOPTNと共遺伝子導入による空胞形成を認める。変異OPTNについて、このタンパクとの結合能の低下と、空胞形成の増加を見出した。この時、タンパク品質管理系の破綻とERストレスの発生を示唆する結果を得た。
また、生体眼組織での発現解析用の抗体について、内在性タンパク認識能の評価を行った。さらに、in utero機能阻害で用いるsiRNAについて、培養細胞の系における発現抑制を検討している。
次年度以降実施予定の、器官培養および生体を用いたin utero遺伝子導入による検討の準備が進んでいる。
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