| 研究概要 |
本申請者はヨーロッパモノアラガイを実験動物として用い,その味覚嫌悪学習機構を研究している.その機構の鍵を握るキー・ニューロン(Cerebral Giant Cell : CGC)をすでに同定しており,本研究ではこの神経細胞に着目した.これまで本申請者らが得てきた結果から,長期記憶形成時に,このキー・ニューロン内では,cAMPの上昇→Aキナーゼの活性化→転写因子cAMP Response Element Binding Protein(CREB1とCREB2)の活性化が起こっていることが知られている.しかし,誰も単一ニューロン内でのCREB1やCREB2の量的変化を正確に示した者はいない.そこで本研究の目的は,このCREB1とCREB2のタンパク質としての個数の変化を,キー・ニューロン1個内で定量できる方法を提示することである.今年度はまずはELISA法の至適pHと酵素サイクリング法の至適pHなど,条件検討を行った.反応効率を比較しながら,反応系全体としての至適pHならびに至適反応温度を決定し,また,基質や酵素の量比も決めて行った.さらには,作成済みのCREB1とCREB2タンパク質の抗体に対して,酵素であるアルカリ・ホスファターゼ(ALP)を標識した.抗体と酵素との架橋剤や架橋方法についていくつかを試してみて,もっとも効率よく反応できる系を作り上げた.その上で,ELISA法と酵素サイクリング法とを組み合せて,互いの反応系が影響を及ぼし合う可能性を検討した.検討の結果,基質の新規合成を試みることが必要であることがわかり,現時点ではすでに最良のものを得ることができている.
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