研究課題
本研究では、BiFC(Bimolecular fluorescence complementation)法を用いて特定のプロテインキナーゼの基質を網羅的に、かつ簡便に探索する方法を構築しその有用性を検証することを目的としている。本年度の研究では、まず、BiFCを用いたプロテインキナーゼの基質スクリーニングが可能かどうかを判定するため、プロテインキナーゼとその基質として明らかになっている、イネのOsMEK1(Mitogen-activated protein kinase kinase)とOsMAPKのC末端側にそれぞれVenusのN末端半分とC末端半分を融合したタンパク質を発現するベクターを作成し、これを同時に大腸菌に形質転換した。それぞれのベクターを導入した大腸菌を固体培地上で生育させた後、メンブレンにそのコロニーを転写し、IPTGを用いて両タンパク質を発現させ、実体蛍光顕微鏡でコロニーを観察した。その結果、両タンパク質が発現した大腸菌では、BiFC由来の蛍光が認められ、大腸菌を用いた本法がプロテインキナーゼのスクリーニングとして有用であることが確かめられた。さらに、VenusのC末端半分と融合した形で発現する植物のcDNAライブラリーを構築するために、すべての読み枠に対応した6種類の発現ベクターを作成した。このベクターを用いて予備的にcDNAライブラリーを作成し、BiFCによるスクリーニングを行ったところ、短い断片が挿入されたベクターでは非特異的なBiFC蛍光が認められることが明らかになった。このことは、作成するcDNAライブラリーのインサート長がある程度必要であることを示している。本法を用いてプロテインキナーゼの基質を探索する場合、使用するcDNAライブラリーはインサート長を調整することが必要であることが明らかになった。
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