| 研究課題/領域番号 |
21659078
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| 研究機関 | 山梨大学 |
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研究代表者 |
範 江林 山梨大学, 大学院・医学工学総合研究部, 教授 (60272192)
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| 研究分担者 |
小池 智也 山梨大学, 大学院・医学工学総合研究部, 助教 (40432158)
柴田 信光 山梨大学, 大学院・医学工学総合研究部, 医学研究員 (40452130)
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| キーワード | CETP / クローン / ノックアウト / ウサギ / HDL / 高脂血症 / 動脈硬化 |
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| 研究概要 |
1.体細胞による核移植法でノックアウトウサギを作製するために、まず、CETP^<-/+>線維芽細胞の樹立を行った。まず、妊娠14日目のウサギ胎児から皮膚の線維芽細胞を単離して、15代目まで系代培養を行った。同定した結果、10代目までの細胞(97%)は染色体数が正常であることが確認された。
2.ウサギCETPゲノムのエクソン3 upstreamとエクソン6 downstreamを有しているノックアウトベクターを作製した。電気穿孔法によりウサギ胎児線維芽細胞への遺伝子導入を行った結果、1142個のG418抗生物質耐性細胞株が得られている。来年度では、PCR法とサザンプロット法によるこれらの細胞CETP遺伝子を同定すると共に、陽性細胞株の染色体数も確認する。
3.CETPノックアウトウサギの作製は最終の目的とするが、CETP^<-/+>線維芽細胞の樹立を行いながら、核移植によるクローンウサギ作製に必要な技術を熟成させる必要がある。そのために、妊娠14日目のWHHLウサギの胎児皮膚から線維芽細胞を単離系代培養した。また、同じ手法で、我々が開発したヒトアポAIIトランスジェニックウサギから胎児線維芽細胞の単離も行った。来年度より染色体数の正常線維芽細胞を用い、核移植を行う。
4.Zinc Finger Nuclease法によるノックアウトラットの技術がウサギにも転用する可能性を検討した。ウサギCETPゲノム配列を基にして、マイクロインジェクションに必要なベクターを設計した。
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