| 研究課題/領域番号 |
21659203
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| 研究機関 | 宮崎大学 |
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研究代表者 |
桑迫 健二 宮崎大学, フロンティア科学実験総合センター, 准教授 (20381098)
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| 研究分担者 |
加藤 丈司 宮崎大学, フロンティア科学実験総合センター, 教授 (20274780)
北村 和雄 宮崎大学, 医学部, 教授 (50204912)
永田 さやか 宮崎大学, 医学部, 助教 (00452920)
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| キーワード | オーファン受容体 / 安定発現系 / FACS解析 / FRET解析 / 新規リガンド |
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| 研究概要 |
1.ヒトオーファン受容体の選定と安定発現系の樹立:
(1)オーファン受容体の選定およびクローニング:前年度に引き続き、循環系の臓器に高発現している残りのオーファン受容体をPCRにてクローニングした(一部は市販のものを購入した)。
(2)オーファン受容体のタグ融合遺伝子の構築:HEK-293細胞に遺伝子導入したオーファン受容体が完全な形で細胞膜に発現したことを蛍光顕微鏡とFACS解析で確認するために、各遺伝子の5'端と3'端にそれぞれV5タグ(約10個のアミノ酸残基)とクラゲの各蛍光タンパク(ECFP,EGFP,EYFP)の遺伝子を融合させた。
(3)オーファン受容体のタグ融合遺伝子の安定発現系の作製:前年度と同じ方法で、オーファン受容体のタグ融合遺伝子をHHEK-293細胞に導入し、薬剤選別後に安定発現系のクローン化を行った。FACS解析にてターゲット受容体のタンパク発現の低いクローンを複数獲得した。現在も他の受容体のクローン化を進めている。
2.選定したヒトオーファン受容体のリガンドの探索:
上記の安定発現系に循環系の組織抽出液(ブタの心房、心室、肺、腎臓、副腎およびヒト褐色細胞腫)を添加し、リガンド探索分野で報告例のないアッセイ法(3種)を用いて解析を進めた。
また、今年度からFACS解析で、各M-RAMP(5'端にHAタグを付加した受容体活性調節タンパク)の細胞膜発現を増加させるオーファン受容体(主にFamily A)のスクリーニングを開始した。
さらに、ターゲットの受容体を必ずGsタンパク(cAMP産生系)と共役させ、かつ、リガンド依存性に細胞内移行させる画期的な方法を見出し、リガンド探索に応用すべく条件検討を開始した。
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