| 研究課題/領域番号 |
21659203
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| 研究機関 | 宮崎大学 |
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研究代表者 |
桑迫 健二 宮崎大学, フロンティア科学実験総合センター, 准教授 (20381098)
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| 研究分担者 |
加藤 丈司 宮崎大学, フロンティア科学実験総合センター, 教授 (20274780)
北村 和雄 宮崎大学, 医学部, 教授 (50204912)
永田 さやか 宮崎大学, 医学部, 助教 (00452920)
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| キーワード | オーファン受容体 / 安定発現株 / FACS解析 / FRET解析 / 新規リガンド |
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| 研究概要 |
1.ヒトオーファン受容体の選定と安定発現株の樹立:
(1)ヒトオーファン受容体の選定およびクローニング:
独自のRT-PCRで循環系の臓器に最も高発現しているオーファン受容体を複数選定し、PCRによるクローニングを行った。PCRで獲得しにくい遺伝子(一部)は市販のものを購入した。
(2)ヒトオーファン受容体のタグ付き遺伝子の構築:
汎用されているHEK(ヒト胎児腎)-293細胞に遺伝子導入したターゲットのヒトオーファン受容体が完全な形で細胞膜に発現したことを蛍光顕微鏡とFACS解析で確認するために、各遺伝子の5'端と3'端にそれぞれ約10個のアミノ酸残基からなるV5タグ(2連)とクラゲの各蛍光タンパク質(ECFP,EGFP,EYFP)の遺伝子を目的に応じて融合させた。
(3)ヒトオーファン受容体のタグ融合遺伝子の安定発現株の作製:
ターゲットのヒトオーファン受容体のタグ付き遺伝子をHHEK-293細胞に導入し、薬剤選別後に安定発現株のクローン化を行った。FACS解析(フローサイトメトリーを用いた独自の解析法)を用いて、これまでの経験を基にアッセイに最適なクローン(蛍光輝度の低い、すなわち、受容体の発現の低いクローン)を複数獲得した。
2.選定したヒトオーファン受容体のリガンドの探索:
循環系の内因性ペプチドが豊富に存在し、その精製が容易なヒトの褐色細胞腫と入手が容易なブタの臓器(左心房、左心室、肺、副腎)を大量に抽出した。これらの組織抽出物を上記の安定発現株に添加して、リガンド探索分野で報告例のない我々のアッセイ((1)オーファン受容体のリン酸化を利用したアッセイ法、(2)オーファン受容体の細胞内移行を利用したアッセイ法、(3)オーファン受容体の立体構造の変化を利用したアッセイ法)を駆使して、新規のリガンド探索を試みたが、現時点で、目的の新規生理活性ペプチドの発見には至らなかった。
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