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主にウイルスベクターを用いた従来の血友病の遺伝子治療法は、投与の繰り返しによるウイルス殻に対する抗体の出現やホスト染色体への挿入による癌化の懸念などの問題が明らかとなってきた。本年度は、遺伝子搭載サイズに制限がなく安定に自律複製するヒト人工染色体(Human Artificial Chromosome : HAC)ベクターを用いて、こうした問題を解決する新規の血友病の遺伝子治療法の開発研究を行った。また、補充療法の重大な副作用である中和抗体(インヒビター)の産生を抑制することを目的として、発現には血小板第4因子(Platelet factor 4 : PF4)のプロモーター領域を用い、凝固第VIII因子を血小板特異的に発現させて、出血部位でのみ活性化血小板から放出させることを試みた。PF4プロモーターは強力で厳密な血小板特異的発現のために上流-2kbpまでの領域を用い、発現ユニットの両端はトリβグロビンHS4インスレータで挟んだ。VIII因子発現ユニットは1～4コピーを挿入し、巨核芽球性白血病細胞のUT-7/GM細胞に導入した。トロンボポエチンで巨核球/血小板への分化を誘導したところ、VIII因子がコピー数依存的に発現することが確認された。蛍光in situハイブリダイゼーション法(FISH)による核型解析により、HACはホスト染色体とは独立して存在することが確認された。HACはマウスiPS細胞に導入してキメラマウスを作製し、現在、in vivoにおける血小板特異的発現を検証中である。
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