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凝固第VIII因子の遺伝子異常により発症する血友病Aでは、主にウイルスベクターを用いた遺伝子治療法の開発が進められてきたが、抗ウイルス抗体の出現や癌化の懸念などが払拭できない。本研究では、遺伝子搭載サイズに制限がなく安定に自律複製するヒト人工染色体(Human Artificial Chromosome : HAC)ベクターを用いて、凝固因子やその安定化因子などの発現ユニットを同時に多コピー搭載した極小染色体HACを構築し、安全性が高く効率的な遺伝子治療法の開発などを目指す。本年度は第VIII因子搭載HAC(FVIII-HAC)の構築、マウスiPS細胞への導入、これを用いたキメラマウスまでの作製までを行った。第VIII因子に対する中和抗体産生の抑制を期待し、第VIII因子を血小板特異的に発現させるためにPlatelet factor 4 (PF4)プロモーター(大阪大学・土井健史教授より供与)を選択した。線維芽細胞発現用に構築した第VIII因子のマルチコピー発現ユニットのCAGプロモーターと置換し、CHO細胞保持の田Cに搭載した。このFVIII-HACが宿主染色体とは独立に保持されていることを蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)解析により確認した。巨核球系細胞:UT-7/GM(山梨大・小松則夫教授より供与)に移入し、分化とコピー数に依存した発現を観察した。微小核融合法によりHACをiPS細胞に移入し、FVIII-HACの独立性を確認した後に、in vitroにおいて巨核球へ分化誘導させた。その結果、分化マーカーのGPIIb/IIIaの発現に伴い、活性を有する第VIII因子の発現が観察された。このiPS細胞を用いてキメラマウスを作製し、HACベクターに搭載のGFP遺伝子の発現を指標に各種臓器でのHACの安定な保持を確認した。現在、第VIII因子の発現や治療効果について検討中である。
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