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昨年度までに血小板特異的にVIII因子を発現させるためにPlatelet factor 4(PF4)プローモーターを選択し、その下流にVIII因子遺伝子を配置した発現カセットをタンデムに4コピー搭載したヒト人工染色体ベクターを構築し、微小核細胞融合法によりiPS細胞に移入した。本年度は、このiPS細胞を用いてキメラマウスを作製し、VIII因子の発現解析を行った。具体的には、各臓器のRT-PCRを行い、骨髄細胞でのVIII因子の発現を確認した。また、骨髄細胞および血小板の免疫染色を行い、巨核球/血小板マーカーのIIb/IIIa陽性細胞を検出し、かつ、HACベクター上に搭載しているGFP遺伝子の発現を指標にHACがIIb/IIIa陽性細胞に安定に保持されていることを確認した。さらに、IIb/IIIa陽性細胞のみでのVIII因子の発現を確認することができた。他方、OP9 stromal細胞を用いてFVIII-HAC保持iPS細胞をin vitroにおいて巨核球/血小板へ分化誘導させ、VIII因子の発現を確認し、FVIII-HAC保持iPS細胞が実際の移植治療で用いる血小板前駆体細胞あるいは血液幹細胞へと分化可能であることが示唆された。しかし、キメラマウスの種々の臓器におけるGFP蛍光観察を行ったところ、骨髄細胞は他の臓器に比較して蛍光強度が弱いことが明らかになった。実際にゲノムPCRでHAC保持率を測定したところ、骨髄細胞のみにおいてHAC保持率が低下していることが明らかとなった。これは、マウス細胞では種差によりヒト由来人口染色体が不安定である可能性が考えられ、現在、同様のVIII因子発現カセットを4コピー搭載したマウス人工染色体ベクター(FVIII-HAC)を構築し、同様に骨髄での保持率の安定なキメラマウスの作製も行いつつある。
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