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外有毛細胞(OHC)膜内のモーター蛋白prestinには、機能を発現しているものと機能非発現のものとが共在している可能性が予備実験から示唆された。機能非発現のものを活性化させprestin至適発現密度を回復させることができれば、障害された運動能の再生が可能となる。
前年度はG蛋白質による細胞内シグナル伝達機構に着目し、細胞内にG蛋白質のアゴニストであるGTP-γ-S(Guanosine 5'-O-(3-thiotriphospkate)tetralithium salt)を投与によるOHC運動能への影響を、electromotility、electromotilityを反映する電位依存性の膜容量(NLC)変化および細胞長の変化として検討した。今年度はG蛋白質のアンタゴニストであるGDP-・-S(Guanosine 5'-O-(2-thiodiphosphate)を細胞内へ投与し、そのOHC運動能への影響を、electromotilityを反映する電位依存性の膜容量(NLC)変化として検討した。
方法
1)Corti器を摘出し酵素処理後、外有毛細胞を単離した。2)細胞外液、細胞内液ともionic blocking solutionをもちい、いずれもpH7.2に調整した。浸透圧は内液外液ともgulcoseで300m0smに調整して使用した。
3)パッチクランプはwhole-cell patcb clamp modeで解析した。
結果
1)G蛋白質を不活性化させるGDP-・-Sを細胞内液に溶解し、600μMとしてパッチピペットのガラス電極を通して外有毛細胞内に投与し5分間作用させた。まずM・CD(1mM)溶液を4分間灌流。次いでコレステロール(1mM)を灌流させた。この間NLCを1分毎に測定した。
2)コントロール群ではコレステロール投与によりholding potential(V=0mV)ではcapacitanceの減少が観察された。一方、GDP-・-Sを細胞内投与した群ではコレステロールによるcapacitanceの減少が抑制された。
3)NLCへの効果:コントロール群ではNLCが過分極方向へshiftするのに対し、細胞内にGDP-・-Sを投与した群では、NLCのshiftが有意に抑制された(p<0.05)。
前年度と今年度の結果より、OHC膜内のモーター蛋白prestinによるelectromotilityはOHC細胞膜のcholesterolによって生じる調節を受けはており、その機序としてG蛋白による細胞内シグナル伝達系が関与している可能性が示された。
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