| 研究概要 |
本年は、ヒストン脱メチル化酵素Jmjd1aの標的遺伝子解析を行うために、Mouse Embryonic Fibloblast(MEF)の作製系を樹立し、それを用いてChIPシークエンス行った。ChIPシークエンスの条件検討には非常に多くの時間を費やしたものの、結果的にピストンH3K9me2,H3K9me3抗体を用いて再現性のあるChIP-PCR、ChIPシークエンスを行うことができるようになった。その結果、代謝関連遺伝子や細胞周期関連遺伝子群のプロモーター領域にJmjd1aノックアウトマウス由来のMEF細胞特異的にH3K9me2,H3K9me3レベルが増大している結果が得られた。この結果が転写調節に反映することを確認するために引き続きマイクロアレイを用いた発現解析を行う予定である。実際には、ヒストン修飾変化による発現変化は定常状態では少ない印象が得られたため、今後の検討においては何らかの追加的な刺激が必要と考えられる。そのため、低グルコース、高グルコースで刺激したMEFを用いて研究を行うことを予定している。本年度のChIPシークエンスの検討はヒストンH3K9me2,H3K9me3抗体を用いて行ったが、今後はH3K9me1などの抗体のほか、Jmjd1a抗体を使用する予定である。そのため、Jmjd1a抗体作成を行った。当初、Jmjd1aのN末端、C末端の50アミノ酸の抗原を設計してバキュロウィルスの系をもちいて、マウス抗体を作成したが、Jmjd1aを認識する抗体を得ることができなかった。そのため、mid-portionに抗原を設計しなおすこととし、再度抗体作製を行ったところ、ウェスタンブロッティング・免疫沈降の両方でJmjd1aを認識することができる細胞上清を得ることができた。現在、抗体をクローン化してモノクローナル抗体を作成しており、次年度には、ChIPやプロテオミクスの条件等が行うことが期待される。そのことにより、Jmjd1aの直接的な標的遺伝子が明らかになり、その作用機序を解明していけるものと考えている。
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