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本研究は、脳由来神経栄養因子受容体TrkBのサブタイプについて、詳細に分子から行動レベルまで解析することにより、神経回路安定化の分子機構の解明を目的としている。この目的を達成するために、今年度は、まずTrkBサブタイプを、in vivoでノックダウンさせることのできるsiRNAレンチウイルスベクターの作製を行った。TrkBのサブタイプは、細胞内にチロシンキナーゼのあるTK+とチロシンキナーゼを欠いたT1の2種類が存在している。それぞれについて特異性のある配列をデザインしたヘアピン型siRNAを設計し、レンチウイルスベクターを作製後、初代神経細胞培養に感染、ウエスタンブロットによって、TK+、T1のタンパク質発現が低下しているかどうかについて検討した。その結果、TK+、T1ともに有為な低下を認めることができた。
次に、胎児期の脳室に作製したTrkB受容体レンチウイルスベクターの投与法を確立するために、諸条件の検討を行ったが、インジェクション後の胚の発生が上手く進まなかった。次年度の始めには、インジェクション法を確立したいと考えている。
現在、TK+とT1の特異的抗体は、両方ともウサギポリクローナル抗体である。このため、TK+とT1の二重染色はほぼ不可能となっている。この問題を解決するために、T1のモルモットポリクローナル抗体の作製を行い、特異性の高いモルモット抗T1抗体を得た。
以上、今年度は、レンチウイルスベクター、抗体などのツールを得ることができた。次年度は、これらのツールを利用し、TrkBの神経回路安定化の分子機構とその生理学的役割を明らかにしたい。
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