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本研究課題は、二次代謝生合成遺伝子クラスターにコードされる機能未知のラジカルSAM酵素の機能解析を通じて、多種多様な化学構造を有する生理活性天然物の生合成的知見を得ることを目的としている。
まず、アミノグリコシド抗生物質ネオマイシン生合成遺伝子クラスターにコードされるラジカルSAM酵素NeoH(NeoN)の機能解析を行った。予想されたNeoH(NeoN)の基質であるネオマイシンCは入手不可能であったので、リボスタマイシンから酵素的に大量に調製した。次に、グローブボックス中で再構成した組換え酵素を用いて酵素反応を検討した結果、期待した異性化反応を検出することに成功した。SAM非存在下では反応の進行が観測されなかったことから、新規ラジカル機構による異性化反応機構が示唆された。
ゲンタミシン生合成遺伝子クラスターにコードされるラジカルSAM酵素の機能解析に関しても、基質の調製から研究を開始する必要があった。そこで、基質の生合成に必要な生合成酵素遺伝子をクローニングし、大腸菌での発現検討を行っている。
トブラマイシン生合成におけるデオキシ化反応も、機能未知ラジカルSAM酵素により触媒されると推定することが出来たので、その機能解析を進めるべき酵素の発現検討を行っている。
また、微生物が有すると期待したラジカルSAM酵素遺伝子含有二次代謝生合成遺伝子クラスターを、特異的なアミノ酸配列を基に設計したプライマーを用いてPCRによりスクリーニングした。その結果、現在までに二つの微生物中にラジカルSAM酵素遺伝子が含まれていることを確認した。来年度は、これら二つの遺伝子クラスターをクローニングし、さらに異種放線菌にて発現させて、二次代謝産物の構造と遺伝子クラスターの対応付けを行う。
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