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本年度は酵素を用いたタンパク質の安定化技術について検討を行った。モデルタンパク質として赤色蛍光タンパク質EGFP、及び抗EGFR抗体を用いた。これらのN末端及びC末端に酵素の基質配列となるタグ配列を導入した発現ベクターを構築し、大腸菌発現系を用いて発現、精製を行った。また、タグを付加した発現タンパク質は、蛍光及び抗原結合能を維持していることが確認され、タグの付加はタンパク質の機能に影響を与えないことが明らかとなった。その結果から、これらのタグ配列付加タンパク質を大量生産する事に成功した。続いてこれらのタンパク質をタンパク質連結酵素を用いて連結した。反応はタンパク質と酵素を混合するだけであり、非常にシンプルである。連結されたかどうかをSDS-PAGEにより確認したところ、酵素を添加したときにのみ低分子量のバンドが確認された。タグを付加しないタンパク質、及び酵素が存在しないときではバンドの移動は見られなかった。これより、酵素を用いてタンパク質を環状化することに成功した。また、この環状化されたタンパク質はその後も蛍光を維持しており、昨日を維持している事が明らかとなった。更に、これらのタンパク質を大量生産し、酵素を添加する事で環状化タンパク質を大量に調製する事にも成功した。これらのタンパク質の安定性評価について、現在CDスペクトル及び蛍光測定、抗原への結合活性を指標として評価を行っているところである。
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