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2009 年度 実績報告書

ライブラリ共有結合導入によるオリゴ糖転移酵素・基質相互作用安定化と複合体構造決定

研究課題

研究課題/領域番号 21770115
研究機関九州大学

研究代表者

井倉 真由美  九州大学, 生体防御医学研究所, 学術研究員 (60529965)

キーワード膜タンパク質 / オリゴ糖転移酵素 / X線結晶解析 / 古細菌
研究概要

1. 大腸菌で発現させた古細菌P.furiosusのStt3全長タンパク質の大量調製
本酵素はIPTG誘導後に、細胞毒性によると考えられるホスト大腸菌の死滅という問題があった。この問題は、ホストの大腸菌をBL21(DE3)からC43(DE3)に代えることで改善がみられた。さらに、C43(DE3)pLyssについても検討を行ったが、改善されなかった。誘導後の培養温度を検討したところ16℃より37℃で培養した方がOSTの回収量が多いことがわかった。また、可溶化の際の界面活性剤について検討を行った。その結果、ThtonX-100、オクチルグルコシド、ドデシルマルトシドのどの界面活性剤を用いてもOST活性に差は見られなかった。今後はドデシルマルトシドを用いて可溶化を行う。
2. 基質(糖鎖修飾アミノ酸配列)のデザイン
Asn-X-Thr/Serが糖鎖修飾のコンセンサス配列であるが、Xのアミノ酸残基の違いにより糖転移の効率が異なることが知られている。そこで、Xの各位置のアミノ酸残基を19種類変えた蛍光標識ペプチドを作製し、P.furiosus菌体より精製したOSTを用いて活性を測定した。電気泳動により反応物を分離し、蛍光イメージを用いて蛍光検出を行った。その結果、XがValの時に最も活性が高いことがわかった。また、Xの次のアミノ酸をThrもしくはSerにしてOST活性を測定したところ、Xの次のアミノ酸残基がThrの方がOST活性が3倍程度高いことがわかった。そこで今後は、今回デザインしたAsn-Val-Thrを最適配列として用いる。

  • 研究成果

    (2件)

すべて 2010 2009

すべて 雑誌論文 (1件) (うち査読あり 1件) 学会発表 (1件)

  • [雑誌論文] Comparative Structural Biology of Eubacterial and Archaeal Oligosaccharyltransferases2010

    • 著者名/発表者名
      Maita N., et al.
    • 雑誌名

      Journal of Biological Chemistry 285

      ページ: 4941-4950

    • 査読あり
  • [学会発表] 大腸菌膜に発現させたオリゴ糖転移酵素の精製と結晶化2009

    • 著者名/発表者名
      井倉真由美
    • 学会等名
      第9回日本蛋白質科学会年会
    • 発表場所
      熊本
    • 年月日
      2009-05-20

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公開日: 2011-06-16   更新日: 2016-04-21  

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