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本研究では、脂質ラフトに局在する膜タンパク質ストマチンまたはフロチリンによる膜小胞形成機構を解明するため、それらのコアドメインの三次元構造をX線結晶構造解析により明らかにすることをめざした。はじめにヒトのストマチンとフロチリンを大腸菌で大量発現させるため、Hela細胞からRNAを抽出し、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)によりcDNAを得た。得られたcDNAを鋳型としてヒトのストマチンとフロチリンの遺伝子断片をPCRにより増幅してpET21b(+)プラスミドに挿入し、全長プラスミドを得た。さらに膜貫通部位などを除いたコアドメインについても同様にPCRを行いプラスミドを得た。作製したプラスミドを用いて大腸菌BL21(DE3)CodonPlusRIL株を形質転換し、組換え大腸菌からの目的タンパク質の発現を誘導後、タンパク質精製装置AKTA prime plusを用いて、His Bindクロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製を試みた。
ストマチンとフロチリンのコアドメインについて、目的タンパク質の発現が確認できたが、大腸菌を超音波破砕するとほとんどが遠心沈殿画分となった。そこで1-2 M urea処理した後透析によりurea濃度を段階的に下げることで精製を行った。得られた精製サンプルを用いてシッティングドロップ蒸気拡散法により結晶化条件の探索を行っている。引き続き結晶化条件の探索を行うとともに、さらに異なるドメインを調製し結晶化に取り組む予定である。
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