| 研究概要 |
出芽酵母におけるスフィンゴ糖脂質(GSL)の意義を明らかにするために,以下の3つの課題に関して検討を行った。
1.GSL検出プローブの作製
21年度は,出芽酵母からスフィンゴ糖脂質(IPC,MIPC,M(IP)_2C)を精製する系を構築し,モノクローナル抗体作製に使用する抗原として必要なスフィンゴ糖脂質を準備した。22年度は,この抗原を使用して,出芽酵母のスフィンゴ糖脂質に対するモノクローナル抗体を作成する。
2.GSL改変酵母における細胞膜タンパク質の挙動解析
21年度は,マイクロドメインに存在するPmalとマイクロドメィンに存在しないTatlのC末端側にEGFPを融合させたタンパク質を野生型の出芽酵母に発現させ,FRAP解析の実験系の構築に成功した。その実験結果として,Tatl-EGFPよりもPmal-EGFPの方が側方に動いている分子の割合が少ないことが分かった。つまり,出芽酵母において,スフィンゴ糖脂質が形成するマイクロドメインに,細胞膜タンパク質が局在するか,しないかによって,そのタンパク質の側方へ動く分子の割合が決定されることが示された。
3.GSL合成酵素の活性調節機構の解明
Csg1及びCsh1のユビキチン化の意義を明らかにするために,両者の細胞質領域に存在するリジンを全てアルギニンに置換した変異体を作製した。その結果,変異体において,ユビキチン化量が減少することを確認した。この変異体の安定性や細胞内局在を調べることによって,Csg1とCsh1のユビキチン化の生理的意義を明らかにすることができると考えられる。また,Csh1の細胞質領域に存在するアルギニンのクラスターが逆行輸送シグナルとして機能する可能性を調べるために,このアルギニンをセリンに置換した変異体を作製した。その結果,このアルギニンクラスターは逆行輸送シグナルとして機能しないことが明らかとなった。
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