| 研究概要 |
概日リズム発振に必須と考えられている非線形性・時間遅れや周期の温度非依存性(温度補償性)などの特性をもたらす分子機構の詳細な解析を目的として、1.時計タンパク質の精製、および2.時計タンパク質の生化学的解析を行った。
1.時計タンパク質の精製
哺乳類概日時計で中心的役割を担うPERIODタンパク質の発現・精製を試みた。大腸菌発現系を用いてPERIOD2単独もしくは他の時計タンパク質との共発現を試みたところ、Casein kinase Iε (CKIε)の共発現させることで、大腸菌内でのPERIODの安定な発現と精製に成功した。
2.時計タンパク質の生化学的解析
既に我々はPERIOD2のリン酸化部位由来のペプチド基質のCKIεによるリン酸化反応は温度非依存であることを明らかにしている(Isojima, et al., PNAS, 2009)。このペプチド基質内のリン酸化部位の同定を試みたところ、少なくとも6ヶ所のリン酸化部位がペプチド基質内に存在することが明らかになった。このうち最もリン酸化効率の高い2ヶ所のアミノ酸残基にリン酸機を導入したペプチドとの相互作用を測定したところ、リン酸化ペプチドとの相互作用は非リン酸化ペプチドと比べ強固であることが分かった。またリン酸化状態依存的に相互作用の強度が変わることも明らかになった。このリン酸化に依存したペプチド基質との相互作用の変化は、リン酸化反応が温度依存性を示す基質では観察されない。これらの成果は、他段階リン酸化反応とリン酸化状態依存的な相互作用変化が、反応の温度非依存性と非線形性を生み出す上で重要な役割を担っていることを示唆するものである。
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