|
本研究の目的は、研究代表者がこれまでに開発した内在性mRNAのイメージング、定量法を応用して、生細胞内のmRNA・タンパク質同時定量法を確立することである。さらにこれを用いてmRNAの機能である翻訳の活性をリアルタイムに評価し、転写後調節におけるmRNAの機能を解明することを目指している。このため、標的遺伝子として緑色タンパク質(GFP)を選択し、そのmRNAとそれに対応するタンパク質(GFP)濃度を同一細胞内で定量を行うことで、単一細胞内の翻訳活性を評価出来ると考えた。
平成21年度には、GFP mRNAとその翻訳産物GFPを、それぞれ蛍光顕微鏡を用いて定量することを目標とした。GFPm RNAに相補的な蛍光アンチセンスプローブを複数個設計し、一過的にGFPを発現させた生きたCOS7細胞内へ導入した。続いて蛍光褪色後回復法(FRAP)を用いて、細胞内におけるプローブの拡散速度を指標にプローブの細胞内でのmRNAとの結合能を評価した。この結果、GFP mRNAと結合できるプローブが確認された。続いて、このプロープを種々濃度で生細胞内へ導入し、それぞれの細胞内におけるプローブとmRNAとの結合比率を、蛍光相関分光法(FCS)を用いて測定した。この結合型・解離型濃度の比と、プローブの結合解離定数を用いて、個々の細胞に発現しているGFP mRNAの濃度を算出した。さらに、生細胞内GFPの濃度を定量するために、FCSを用いてGFP発現細胞内のGFPを定量的に解析した。GFPの発現量の多い細胞についてはFCSで正確な定量が行えなかったものの、細胞の蛍光強度とGFP濃度の校正曲線を作成することにより高発現の細胞内においてもGFP濃度を定量することが出来た。以上の検討により、単一細胞内においてGFP mRNA及びそれに対応するGFPの同時定量が可能となった。
|
