| 研究概要 |
本研究の目的は、研究代表者がこれまでに開発した内在性mRNAのイメージング、定量法を応用して、生細胞内のmRNA・タンパク質同時定量法を確立し、さらにこれを用いてmRNAの機能である翻訳の活性をリアルタイムに評価することで転写後調節におけるmRNAの機能を解明することである。
本年度は前年度に開発した単一細胞内GFPmRNAおよびGFPの同時定量法を行いて、mRNAと対応するタンパク質の同時定量を行った。まずCOS7細胞にGFP遺伝子を導入し、GFPを安定に発現する細胞株をクローニングしてGFP発現COS7細胞を作製した。この細胞内においてmRNAとGFPの同時定量を行い、個々の細胞で得られたGFP濃度をGFPmRNA濃度で除することにより、単一細胞内におけるmRNA一分子により翻訳されるタンパク質の平均分子数を算出した。
さらに翻訳制御が起きていると報告されているストレス時の細胞内においてmRNAの動態(局在や発現量)と翻訳活性の関連を検討した。ヒ素を用いて酸化ストレス負荷をかけたCOS7細胞において、アンチセンスプローブを用いて内在性mRNAのタイムラプスイメージングを行い、内在性mRNAがストレス顆粒(stress granules, SG)へ局在する過程を可視化した。続いて、ストレス時にSGへ局在した内在性mRNAの翻訳活性を調べるため、mRNAダイナミクスを蛍光槌色後回復法(FRAP)を用いて検討した。その結果、SG内において内在性mRNAは抑留されている成分やSGとの結合・解離の平衡状態にある成分が検出された。一方、SG局在タンパク質は自由に拡散し、細胞質との間でシャトリングしていた。この結果はストレスを受けた細胞内では、翻訳中のmRNAを選択的にSG内に閉じ込めることで翻訳を抑制していることを示唆している。
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