1分子観察解析技術を応用したDNA-タンパク質群相互作用の精密解析

2011 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 21770183
• 研究機関: 群馬大学
• 研究代表者: 大重 真彦 群馬大学, 大学院・工学研究科, 准教授 (00451716)
• キーワード: 1分子解析 / 形態制御 / 可視化技術 / 1本鎖DNA結合タンパク質 / 1本鎖DNA結合ペプチド

研究概要

DNA代謝反応(複製・修復・組み換え反応)は、詳細は異なるが基本的には2本鎖DNAが1本鎖に解離し、DNA合成反応により再び2本鎖に戻る反応が主要な反応である。従来の解析法は電気泳動等による100万分子以上を対象とした分子生物学的手法によって得られたものであるが、DNA代謝反応に関わる反応の素過程は明らかになっていない。そこで、多分子解析では隠れてしまう個々の分子の反応素過程を、1分子に着目し解析することを目的とした。この解析を行うにあたり1本鎖DNA領域に対する効果的な可視化法が確立していない問題点があったが、1本鎖DNA結合タンパク質であるDNA複製因子(Replication ProteinA:RPA)に黄色蛍光タンパク質(YFP)を融合させたRPA-YFPを作成することにより解決し、1本鎖DNAとRPA-YFPの相互作用をマイクロ流路中で1分子レベルで解析を試みた。
DNA合成反応の可視化方法として、DNAポリメラーゼにより合成されていく2本鎖DNAを可視化する方法が考えられる。しかし、2本鎖DNAの蛍光標識剤であるYOYO-1を反応系に添加した場合はDNAポリメラーゼ活性を阻害することがあり、リアルタイムPCRで使用されている蛍光標識剤であるSYBR Greenを添加した場合は蛍光強度が十分でなくDNA分子を観察することが出来なかった。そのため、1本鎖DNAをRPA-YFPにより可視化及び物理的に安定させた後、DNAをポリメラーゼによるDNA合成反応によるRPA-YFPの蛍光の解離を観察することにした。その結果、RPA-YFPの蛍光の解離を観察することに成功した。

研究成果

• [学会発表] 開発した2種類の1本鎖DNA可視化方法の比較検討 (2011)
  • 著者名/発表者名: 村上太滝、川崎祥平、高橋俊介、大重真彦、栗田弘史、松浦俊一、水野武、水野彰、桂進司
  • 学会等名: 第34回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: パシフィコ横浜(神奈川県)
  • 年月日: 2011-12-13
• [図書] DNA Microarrays, Synthesis and Synthetic DNA (2011)
  • 著者名/発表者名: T.Nagata, J.Herrick, S.Paratore, L.Messina, S.Pezzino, D.Bellia, E.Salomone, P.Gangemi, G.Bruno, S.Ferlito, T.D.Prima, M.Mauro, E.Palmeri, V.Albanese, N.Platania, C.Buscarino, A.Gulisano, M.Caruso, A.Ragusa, S.Gangi, F.Basile, S.Cavallaro, E.Cauet, M.Schmidt, G.Giersch, T.Akama, K.Tanigawa, K.Nakamura, A.Kawashima, H.Wu, M.Sue, A.Yoshihara, Y.Ishido, N.Ishii, K.Suzuki, F.F.Andersen, P.Villesen, B.Knudsen, C.Wiuf, A.Desideri, B.R.Knudsen, S.N.Bariyanga, H.A.Tajmir-Riahi, K.Kusakabe, A.Takeshita, H.Abe, T.Kondo, T.Okada, Y.H.Dai, Y.J.Chen, M.J.Liu, H.J.Lee, M.Oshige, S.Katsura
  • 総ページ数: 402
  • 出版者: Nova Science Publishers