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上皮由来Eph4細胞、ZO1(KO)/ZO2(KD)細胞(DKO細胞)を用い、アドヘレンスジャンクション(AJ)の裏打ち細胞骨格であるアクトミオシンリング形成におけるZO1/2の役割と形成に関わるシグナル解析に取り組んできた。アクトミオシンリングの形成においては、Rhoシグナルの時空間的活性制御が必要であることがわかってきたが、時空間的制御にはRhoGEFの存在が推定されていた。本研究において、そのRhoGEFの同定を具体的に進めることができた。ZO1/2依存的に細胞間接着部位に濃縮する2つのRhoGEFたんぱく質XとYを同定することができたので、まず、内在性の抗原を認識する抗体の作製を、ウサギ、ラットを用いて行ったが、内在性の抗原を認識できる良好な抗体を得ることができなかったため、現在、抗原部位の選定を検討中である。Xについては、遺伝子発現系において、ZO1/2依存的な局在パターンを示したことから、ZO1/2との共沈実験を行ったところ、ZO1/2と結合することが示された。この分子について、DKO細胞に発現導入を行なったところ、アクトミオシンリングのAJへの挿入が促進された。さらにドメイン解析を進め、機能ドメインの同定を進めたい。また現在、RNAiによるノックダウン細胞の樹立を進めている。Yについては、ZO1/2との結合はないものの、局在においてZO1/2依存性があるので、GEFのドミナントネガティブ体やインヒビターの実験から、Eph4細胞のアクトミオシンリング形成を蛍光染色により観察を行なっている。現在、これらの実験を統合して、この2つのRhoGEFのAJ構築における役割の分子メカニズム解析を細胞生物学的解析により検討を進めている。
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