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本年度は微量試料からの高効率クロマチンブルダウン法の開発に必要となる細胞・マウスの作成をおこなった。
始原生殖細胞の形成過程およびその維持におけるBlimp1の結合部位の同定に必要なマウスを作出するため、相同組み換えによりBlimp1遺伝子にタグ(EGFPおよびビオチンリガーゼ標的配列(Avitag))を付与した。培養細胞での強制発現実験により、Blimp1はC末端よりもN末端の方がタグの付与に適していることが判明した。したがって、これらのタグが挿入されるようBlimp1 locusにノックインしたES細胞を作出した。
また、少数細胞(~1000個)からのChIP法確立のための実験系として、Oct3/4のC末端がEGFPでタグされた機能的なES細胞を理研CDB丹羽仁史博士に分与していただき、キメラマウスを作出した。また、ビオチンリガーゼを恒常的に発現するES細胞株を理研免疫研の古関明彦博士より分与していただき、Oct3/4のC末端がAvitagでタグされるようノックインした。ES細胞におけるOct3/4の結合部位には十分な知見があるので、少数細胞へのChIP法を最適化するためのコントロールとして用いる予定である。すなわち、多数(～10^7個)の細胞におけるタグ付きOct3/4の結合部位を基準として、細胞数を減らしてChIPおよびゲノムDNA断片の増幅をしたときのデータと比較し、感度・精度・確度を測定する。またOct3/4は多能性の形成・維持だけでなく、生殖細胞形成にも重要であるので、手法の確立にもちいるだけでなく、始原生殖細胞における結合部位を同定することも生物学的に重要であると考えられる。BlimplとOct3/4の、相同組換え実験の一部およびキメラマウス作出は理研CDB変異マウス開発室と共同でおこなった。
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